人工老化处理对桔梗种子生理生化特性的影响

姚侠妹，张瑞娥，偶 春，汪 林，王维根，王 瑞，常二梅

(1 阜阳师范学院 生物与食品工程学院，安徽 阜阳236037；2 中国林业科学研究院 林业研究所，林木遗传育种国家重点实验室，北京100091)

人工老化处理对桔梗种子生理生化特性的影响

姚侠妹1,2，张瑞娥1，偶 春1，汪 林1，王维根1，王 瑞1，常二梅2

(1 阜阳师范学院 生物与食品工程学院，安徽 阜阳236037；2 中国林业科学研究院 林业研究所，林木遗传育种国家重点实验室，北京100091)

【目的】 研究人工老化过程中桔梗种子萌发特性和生理生化指标的变化，揭示其劣变机理。【方法】 以桔梗种子为材料，采用高温(40 ℃)高湿(相对湿度95%)的方法对种子进行人工老化处理，且于0～10 d，隔天测定1次桔梗种子发芽指标、相对含水量和相对电导率、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量以及SOD、POD、CAT活性。【结果】 随着人工老化时间的延长，桔梗种子的发芽势、发芽指数、发芽率和活力指数均下降；种子的质膜透性明显增大，可溶性蛋白含量和保护酶活性则明显下降，而可溶性糖、脯氨酸和MDA含量呈先升高后下降趋势。相关分析表明，发芽指标与SOD活性、POD活性、可溶性蛋白含量呈极显著正相关，与相对含水量呈极显著负相关。【结论】 在人工老化过程中，桔梗种子细胞膜受损，抗逆性物质脯氨酸含量增加，造成渗透调节物质积累和保护酶系统受到破坏，致使种子活力丧失，这可能是引起桔梗种子老化的重要原因。

桔梗；人工老化；种子萌发；生理生化特性

桔梗(Platycodongrandiflorus)为桔梗科桔梗属多年生草本植物，花期7-9月，花暗蓝色，可作基础绿化或植于花坛等环境中观赏，是一种理想的很有前途的草本类花卉；其根可作为药用，具有祛痰、止咳、润肺等功效[1]，需求量大且历史悠久；除了药用外，还可作为新型保健型蔬菜食用，在我国的东北地区及日本、韩国等东亚国家都有用桔梗制成美味菜肴的习惯。桔梗在全国大部分地区均有分布，以我国东北地区为主。桔梗既是一种资源植物，又是一种药、食、观赏兼用的经济植物。

种子在自然常温下的老化需要较长时间，Ellis等[2]认为，在-13～80 ℃对种子进行处理，种子的老化规律是一致的。Rajjou等[3]在对拟南芥种子的老化研究中证明，人工控制老化处理模拟了种子自然老化过程中的细胞生理和分子生化反应。这充分说明人工加速老化方法可以为研究自然老化过程中物质代谢和遗传物质的变化提供可靠的依据，可以用于模拟种子的自然老化过程。人工老化方法以采用高温高湿法处理居多，如蔡春菊等[4]、姚入宇等[5]和周晶等[6]采用此法分别对毛竹、青川产北柴胡和垂穗披碱草种子进行了老化处理。

安徽亳州盛产桔梗，是当地地产药材之一。在生产实践中发现，自然条件下桔梗种子贮藏1年后发芽能力大幅降低。目前，国内外关于桔梗种子劣变及人工老化方法处理后种子的生理生化特性变化的研究尚未见报道。本研究采用高温高湿(温度40 ℃、相对湿度95%)方法，模拟自然条件下桔梗种子的老化过程，分析桔梗种子老化过程中的生理生化特征，探究桔梗种子的劣变机制，以期为实际生产中提高种子质量提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试桔梗种子于2013-10取自安徽省亳州市药材种苗推广站，保存于放有干燥剂的玻璃干燥器中密封保存，试验于2014-03-10-04-21在阜阳师范学院园林植物实验室进行。种子千粒质量 0.932 3 g，初始含水量为6.44%，种子初始发芽率约为84%。在人工老化处理前，将种子于室内自然条件下平衡24 h。

1.2 种子的人工老化

提前2 d将气候培养箱打开，调至相应的温湿度(温度40 ℃，相对湿度95%)，培养箱外接加湿器，每天加满水，使培养箱内部相对湿度稳定在95%。2 d后，称取5包平衡24 h的桔梗种子(每包10 g)，分别标记为2，4，6，8和10，用纱布封装好。每隔1 d向培养箱中放入1份种子，第1天将标有10的袋子放入培养箱，记录时间，并给加湿器加满水；第3天同一时间将标有8的袋子放入培养箱，第5天将标有6的放入培养箱，以此类推，连续10 d。第11天的同一时间将所有种子全部取出，每袋取出部分种子立即测定含水量，其余种子在室温条件下进行种子发芽和生理生化指标测定。所有指标均以未处理的桔梗种子作对照(CK)，每处理3个重复。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 发芽指标 将气候培养箱温度设定为25 ℃，分别称取1 g经过不同时间老化处理的桔梗种子，经质量分数0.5%高锰酸钾溶液消毒15 min后，弃去漂浮在液面上的品质不好的种子，用蒸馏水冲洗3次，每次冲洗20 s，再用吸水纸吸干种子表面的水分，进行种子萌发试验。以湿润滤纸为发芽床。在相同大小的培养皿里垫上2层滤纸，加入5 mL蒸馏水，使滤纸充分湿润，再将消毒的种子均匀地放入培养皿中，每个老化时间处理的种子重复3次，每重复100粒，盖上培养皿，放入事先设置好温度的气候培养箱中，每隔1 d更换1次湿润滤纸，操作与上述相同，且保证滤纸湿润，待种子发芽。从发芽第1天开始计算，10 d后随机选取相同数目的桔梗幼苗，分别测量幼苗的根长(mm)、茎长(mm)和芽长(mm)，计算种子发芽指数和活力指数。各指标按以下公式计算：

发芽势=第5天发芽种子数/供试种子数×100%；

发芽率=第10天发芽种子数/供试种子数×100%；

活力指数=(平均芽长+平均根长)×发芽率[7]；

发芽指数(GI)=∑(Gt/Dt)。

式中：Gt为发芽开始后第t日的发芽种子数；Dt为对应的发芽天数。

1.3.2 种子相对含水量 采用恒温烘干法[8]测定种子相对含水量。

1.3.3 生理生化指标 (1)保护酶活性、可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量。将不同老化时间处理的桔梗种子均匀地铺在湿润的滤纸上，放置12 h使其吸胀，再称取吸胀种子，参考文献[9-10]测定方法，各指标3次重复。 其中超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑法，过氧化物酶(POD)活性测定用愈创木酚法，过氧化氢酶(CAT)活性测定采用紫外分光光度法，丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸比色法，可溶性糖含量采用蒽酮法测定，可溶性蛋白含量用考马斯亮蓝G-250染色法，脯氨酸(Pro)含量测定采用酸性茚三酮显色比色法。

(2)相对电导率。采用电导率仪法[9-10]测定。分别取不同老化时间处理的种子20粒，重复3次。分别用2层纱布包住，做好标记，然后用蒸馏水冲洗3次，每次冲洗20 s，用吸水纸吸干种子表面残留水分，分别装入大试管中，并加入20 mL蒸馏水，在室温条件下浸泡24 h，再用雷磁DDS-11A数显电导率仪测定浸泡液的电导率，记录读数(a1),然后将种子及浸泡液置于100 ℃水浴锅30 min后取出，待其冷却至25 ℃，再用电导率仪测定煮沸后种子浸泡液电导率，记录对应读数(a2)，最后计算种子浸泡液相对电导率[8]。

种子相对电导率=(a1/a2)×100%。

1.4 数据处理与分析

数据采用Excel 2003和SPSS 16.0统计软件进行图形处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 人工老化处理对桔梗种子萌发特性的影响

表1显示，随着人工老化时间的不断延长，桔梗种子相对含水量呈上升趋势，老化处理0～4 d的差异显著，6～10 d的差异不显著；桔梗种子发芽率、发芽势和发芽指数变化规律相同，均表现为下降趋势，且早期下降较快，老化处理6 d的种子发芽率和发芽势与对照相比分别降低了56.52%，68.10%，其中4～6 d种子发芽率和发芽势的下降幅度最大；老化处理2和4 d的种子发芽指数分别为15.41和9.22，下降幅度较大。然而种子老化处理6 d以后，发芽率、发芽势、发芽指数3个指标下降趋势变缓，老化处理至10 d时，发芽率较对照下降了83.01%，发芽势下降91.43%，发芽指数下降89.97%。由此看出，种子发芽势对老化处理更为敏感，种子发芽能力基本丧失。以上结果说明，随着人工老化时间的延长，种子老化程度不断加深，种子含水量逐渐增大，细胞膜结构和功能发生了变化，加速了种子内部物质的新陈代谢和种子老化的步伐，抑制了种子萌发，降低了种子活力；且随着老化时间的延长，抑制效果更为明显，直到末期种子萌发能力基本丧失。

注：同列数据后标不同小写字母者表示处理间存在显著性差异(P<0.05)。下表同。

Note:Different lowercase letters mean significant differences (P<0.05).The same below.

图1显示，随着人工老化时间的延长，桔梗幼苗的根长、茎长均略有下降，在老化处理0～6和8～10 d 2个阶段，种子根长和茎长变化差异不显著(P>0.05)，而6～8 d则变化明显，根长由13.07降到12.37 mm，茎长由11.93降到10.67 mm，与对照相比，分别降低了4.87%和9.92%。随着人工老化时间的延长，芽长持续下降，老化处理4 d的种子芽长为5.93 mm，与对照差异显著；老化10 d种子芽长显著下降，为3.13 mm。而随着人工老化时间延长，活力指数下降迅速，老化2，4，6，8和10 d的种子活力指数分别较对照下降了22.35%，40.58%，62.51%，76.28%和88.07%，老化处理10 d种子活力基本丧失，说明老化处理对桔梗幼苗生长有抑制作用，随老化程度的加深抑制作用增强，种子活力在老化过程中不断减小，最终活力基本丧失，直至死亡。

2.2 人工老化处理对桔梗种子保护酶活性的影响

表2显示，在桔梗种子老化进程中，SOD、POD和CAT活性变化趋势相同，均随着老化时间的延长而不断下降，且下降幅度较大，老化处理后的3种酶活性均显著低于对照。3种酶活性变化趋势与种子活力指数的变化趋势高度一致。其中SOD活性在处理4～6 d变化迅速，4，6 d分别较对照下降了21.46%和39.18%，各处理间差异显著(P<0.05)。POD活性在老化初期(0～2 d)和后期(8～10 d)下降较快，而在老化中期变化较为平缓，与对照相比，老化4，6，8 d POD活性分别下降了40.81%，41.48%和47.35%。CAT活性在人工老化处理初期(0～2 d)下降较快，2 d时即下降了24.98%；但老化处理6，8，10 d CAT活性变化基本保持稳定，分别较对照下降了32.48%，33.08%和34.19%，且以上3个处理间差异不显著。说明随老化时间的延长，细胞清除过氧化物的能力越来越弱，细胞活性氧代谢平衡受到了破坏，使种子发生了劣变。

2.3 人工老化处理对桔梗种子可溶性糖含量的影响

图2显示，桔梗种子中的可溶性糖含量随着人工老化时间的延长先增加后下降。老化0～6 d可溶性糖含量呈上升趋势，且各处理间差异总体显著(P<0.05)，与对照相比，老化2，4 d时可溶性糖含量分别上升了17.97%和39.59%，老化6 d时达到最高值，上升了49.82%；之后呈下降趋势，老化8 d时可溶性糖含量显著低于6 d，但仍较对照上升了9.35%；老化8～10 d可溶性糖含量下降趋于平稳，与对照间差异不显著，此时继续人工老化处理对桔梗种子可溶性糖含量无明显影响。说明老化6 d对桔梗种子可溶性糖含量的影响最为显著，种子浸出液中可溶性糖含量增多，说明人工老化处理对膜的透性造成了损伤。

2.4 人工老化处理对桔梗种子可溶性蛋白含量的影响

图3显示，桔梗种子内可溶性蛋白含量随人工老化时间的延长整体呈下降趋势。老化2 d的种子可溶性蛋白含量下降到4.61 mg/g，与对照相比下降了19.97%(P<0.05)；老化2～6 d时下降趋势变缓，老化4和6 d可溶性蛋白含量分别较对照下降了30.38%和41.49%；老化8 d时，桔梗中可溶性蛋白含量较对照下降了78.82%，与老化6 d差异显著(P<0.05)；老化8～10 d可溶性蛋白含量变化趋于平稳，基本保持不变。说明老化处理6 d对桔梗种子内可溶性蛋白含量的影响最大。

图2 人工老化处理对桔梗种子可溶性糖含量的影响
Fig.2 Effect of artificial aging on soluble sugar content ofPlatycodongrandiflorusseeds

图3 人工老化处理对桔梗种子可溶性蛋白含量的影响
Fig.3 Effect of artificial aging on soluble protein content ofPlatycodongrandiflorusseeds

2.5 人工老化处理对桔梗种子MDA含量的影响

种子在发生劣变的过程中，其内部发生一系列的氧化催化作用会造成膜脂过氧化，而MDA作为膜脂过氧化的主要终产物之一，常被作为检测种子受伤害程度的指标之一[4]。

图4显示，随着人工老化时间的延长，桔梗种子中MDA含量的变化趋势与可溶性糖含量基本一致，即先上升后下降，并在4 d时达到最高值。人工老化初期(0～2 d)MDA含量上升不明显，2 d时仅上升5.99%(P>0.05)；老化2～4 d上升迅速，4 d时MDA含量达到最大值，较对照增加了31.38%；老化6 d时MDA含量开始下降，但6和8 d MDA含量仍较对照分别上升17.94%和8.52%。说明人工老化处理4 d对桔梗种子MDA含量影响最显著。

2.6 人工老化处理对桔梗种子脯氨酸含量的影响

图5显示，随着人工老化时间的延长，桔梗种子中的脯氨酸含量与可溶性糖和MDA含量的变化趋势一致，即先上升后下降，于8 d达到峰值。老化2 d时脯氨酸含量较对照上升24.22%，4 d时上升了30.85%，6 d时上升了51.36%，8 d时上升了117.20%，显著高于其他处理(P<0.05)；老化后期(8～10 d)桔梗种子中的脯氨酸含量又迅速下降，与对照相比，10 d时下降58.17%。说明桔梗种子老化8 d时种子抗逆性达到最佳，继续老化就会破坏种子的抗逆性。

图4 人工老化处理对桔梗种子MDA含量的影响
Fig.4 Effect of artificial aging on MDA ofPlatycodongrandiflorusseeds

图5 人工老化处理对桔梗种子脯氨酸含量的影响
Fig.5 Effect of artificial aging on Pro content ofPlatycodongrandiflorusseeds

2.7 人工老化处理对桔梗种子浸出液相对电导率的影响

质膜透性可用相对电导率来表征。人工老化处理对桔梗种子相对电导率的影响如图6所示。

由图6可知，随着人工老化时间的延长，桔梗种子浸出液的相对电导率不断增加。老化0～6 d种子浸出液相对电导率变化平缓，老化2，4，6 d时相对电导率分别较对照上升16.49%，30.55%和44.20%；8和10 d相对电导率上升迅速，分别较对照上升了94.6%和103.00%。说明随着人工老化时间的延长，桔梗种子细胞膜功能不断受损，膜透性不断增加，有更多的细胞内物质渗漏，细胞膜完整性受到了破坏。

2.8 不同老化程度桔梗种子活力指标间的相关分析

不同老化程度桔梗种子的发芽指标与生理生化指标间的相关分析结果见表3。由表3可知，与发芽指标存在显著或极显著相关关系的有SOD、POD、CAT活性及脯氨酸、可溶性蛋白含量和相对含水量、相对电导率，其中SOD活性、POD活性、可溶性蛋白含量、相对含水量与发芽指标呈极显著相关，说明SOD活性、POD活性、可溶性蛋白含量、相对含水量是可较准确判断桔梗种子劣变阶段的指标。可溶性糖和MDA含量与发芽指标没有显著相关性。

注：**和*分别表示在P=0.01或P=0.05水平显著相关。

Note: **and* indicate significant correlations atP=0.01 orP=0.05 levels,respectively.

3 结论与讨论

利用人工老化方法对植物种子进行处理，模拟自然条件下种子的老化劣变过程，可以缩短试验时间，仅需几天就可完成种子活力的测定，是一种简单可行且省时的试验手段。采用高温高湿的人工老化方法时，随着高温高湿作用时间的不断延长，种子内部生理生化反应越来越明显，种子活力及抗氧化特性在处理一定时间后基本丧失，最终导致不可逆转性死亡。

本研究发现，桔梗种子发芽势、发芽率等均随人工老化时间的延长呈下降趋势，这2个指标是反映种子活力的可靠指标，表明人工老化处理显著降低了种子的活力和生活力。在人工老化过程中，桔梗种子萌发力的衰退与细胞膜完整性的受损相关。大量文献表明，人工老化胁迫的种子细胞膜受损，细胞膜损伤表现为电解质和代谢产物渗透量增加，如糖类、无机离子等物质[11-13]。质膜受损程度可用表征细胞膜透性的浸出液相对电导率来表示。本研究中，桔梗种子老化进程中，种子浸出液相对电导率增大，即随着种子老化程度加深，种子细胞膜结构发生变化，致使其透性增加，这与刘明久等[12]和张永娟等[13]的研究结果一致。此外，种子在人工老化处理过程中，种子抗氧化防御系统的协调作用能力逐渐丧失，表现为CAT、SOD和POD等保护酶活性降低，可见膜脂过氧化作用是引起或加剧桔梗种子老化劣变的重要原因。MDA含量反映了逆境环境下植物生物膜受活性氧破坏的程度[14]。本研究中，桔梗种子MDA含量随着人工老化时间的延长变化幅度并不明显，且与桔梗种子发芽指标相关性不显著，这与孙春青等[15]和薄丽萍等[16]所报道的结果一致，但与前人在大白菜[17]和棉花种子[18]人工老化试验中MDA含量变化的结果不符。

综上所述，在40 ℃高温、相对湿度95%条件下，桔梗种子活力明显降低，加速了种子的老化。人工老化处理的桔梗种子质膜结构受到破坏，内溶物质外渗，保护酶活性下降，质膜过氧化作用加剧，有害物质积累、物质能量代谢受到影响等一系列因素造成种子老化，种子萌发受到了抑制。在老化进程中，桔梗种子发芽指标和保护酶活性与对照相比均明显减小；而能反映植物对抗逆环境条件反应强弱的MDA和脯氨酸含量分别在老化4和8 d时达到最高值；能够降低细胞渗透势的可溶性糖含量在老化6 d时达到最高值，说明不同人工老化时间对桔梗种子生理生化特性的影响也不同。在桔梗种子老化进程中，种子SOD活性、POD活性、可溶性蛋白含量、相对含水量反应比较敏感，它们与种子发芽指标(发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数)极显著相关。由此可见，种子老化是一个非常复杂的过程，涉及到一系列的生理生化变化。

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Effects of artificial aging on physiological and biochemical characteristics ofPlatycodongrandiflorusseeds

YAO Xia-mei1,2,ZHANG Rui-e1,OU Chun1,WANG Lin1, WANG Wei-gen1,WANG Rui1,CHANG Er-mei2

(1SchoolofBiotechnologyandFoodEngineering,FuyangTeachersCollege,Fuyang,Anhui236037,China;2KeyLaboratoryofTreeBreedingandCultivation,ResearchInstituteofForestry,ChineseAcademyofForestry,Bejing100091,China)

【Objective】 This study investigated changes in seed germination and physiological and biochemical characteristics ofPlatycodongrandiflorusseeds during artificial aging to reveal seed deterioration mechanism.【Method】 In this experiment,P.grandiflorumseeds were treated with high temperature (40 ℃) and humidity (95%).In 0- 10 days,germination indexes and physiological and biochemical indexes ofP.grandiflorumseeds including photosynthetic pigment,relative water content,relative electric conductivity,malondialdehyde (MDA),free proline (PRO),soluble sugar,soluble protein,superoxide(SOD),peroxidase(POD),and catalase(CAT) were measured every other day.【Result】 With the increase of artificial aging time,germination potential,germination index,vigor index,soluble protein content and seed protective enzyme activity decreased,plasma membrane permeability increased,and soluble sugar,PRO and MDA content decreased after initial increase.The correlation analysis indicated that there were very significant positive correlations between SOD,POD,soluble protein content and seed germination indexes while there were very significant negative correlations between relative water content and seed germination indexes.【Conclusion】 During artificial aging,cell membrane ofPlatycodongrandiflorusseeds was damaged and internal resistance material PRO content increased,which caused the accumulation of osmotic adjustment substances and damaged protective enzyme system.This resulted in the loss of seeds vigor,and the possible reason for seeds aging.

Platycodongrandiflorus;artificial aging;seed germination;physiological and biochemical characteristics

2014-06-16

国家自然科学基金项目(31300555)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(RIF2013-12) ；抗衰老中草药省级科研机构校级委托专项(2013KSLZX02)；安徽省教育厅自然科学研究项目(KJ2013A207)；安徽省高校省级优秀青年人才基金项目(2012SQRL114)；安徽省高校省级自然科学研究项目(KJ2012Z308)；阜阳师范学院卓越人才培养计划项目(2012ZYJH03)；阜阳师范学院学生科研课题(fsyxsc201435)

姚侠妹(1981-)，女，安徽蚌埠人，讲师，在读博士，主要从事植物地理与应用研究。E-mail:yaoxiamei@126.com

常二梅(1981-)，女，河北邯郸人，助理研究员，博士，主要从事林木抗性研究。E-mail：changem@caf.ac.cn

时间:2015-01-05 08:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.02.028

S567.23；Q945.78

A

1671-9387(2015)02-0203-07

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