番茄灰霉病菌室内毒力测定及药效试验

黄 海，张 鑫，邹 杭，杨海艳，曹晶晶，安德荣

(旱区作物逆境生物学国家重点实验室/西北农林科技大学植物保护学院，陕西 杨凌 712100)

番茄灰霉病菌室内毒力测定及药效试验

黄 海，张 鑫，邹 杭，杨海艳，曹晶晶，安德荣

(旱区作物逆境生物学国家重点实验室/西北农林科技大学植物保护学院，陕西 杨凌 712100)

【目的】 研究解淀粉芽孢杆菌对番茄灰霉病的防治效果，为该药剂的应用提供参考。【方法】 采用菌丝生长速率法和孢子萌发法，分别测定了解淀粉芽孢杆菌(WP)、枯草芽孢杆菌(WP)、40%多菌灵(WP)、50%异菌脲(WP)和40%嘧霉胺(WP)对番茄灰霉病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用及有效抑制中质量浓度(EC50)；采用盆栽试验和田间试验，分别测定了以上5种药剂对番茄灰霉病的防治效果。【结果】 解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、40%多菌灵、50%异菌脲和40%嘧霉胺对番茄灰霉病菌菌丝生长抑制的EC50分别为946.28，757.19，75.36，8.95和5.53 μg/mL，对孢子萌发抑制的EC50分别为1 665.56，1 416.16，241.90，37.32和21.35 μg/mL。盆栽试验结果显示，解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、40%多菌灵、50%异菌脲和40%嘧霉胺750倍液的保护效果分别为68.47%，70.14%，74.18%，74.13%和80.63%。田间试验结果显示，解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、40%多菌灵、50%异菌脲和40%嘧霉胺750倍液的防治效果分别为63.37%，64.83%，69.56%，73.49%和75.55%。【结论】 解淀粉芽孢杆菌对番茄灰霉病菌的室内毒力作用和田间防治效果与枯草芽孢杆菌相当，可以作为田间防治番茄灰霉病菌的一种辅助药剂。

解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂；番茄灰霉病；药效试验；辅助药剂

随着番茄生产的发展，保护地番茄栽培面积的不断扩大，番茄上的各种病害也在逐年增加，已成为番茄生产中的一大障碍。其中由灰葡萄孢引起的番茄灰霉病为当前番茄生产上的重要病害，已在全国各地普遍发生，并造成严重减产减收。一般发病田块番茄灰霉病造成的产量损失为20%～40%，重病田块达到60%以上[1]。种植抗病品种能最大限度地降低番茄灰霉病危害，但是由于抗源材料的缺乏，番茄抗灰霉病育种基本处于停滞状态[2]。因此目前防治番茄灰霉病以化学药剂为主，防治过程中存在用药量大、成本高、防效差、污染重、农药残留超标等问题[3]。而在番茄灰霉病发生普遍的地区，使用拮抗微生物进行防治，可以减少化学农药的使用，解决农药残留问题，延缓病菌抗药性产生[4]。随着人们对环境问题的日益关注和对绿色食品需求的提高，微生物防治日益成为控制番茄灰霉病的一条重要而有效的途径。国内外报道了多种细菌、真菌及放线菌对番茄灰霉病菌具有一定的抑制作用，其中芽孢杆菌防治番茄灰霉病是近年的研究热点[5]。但对于芽孢杆菌生防菌株的研究大多仍处于实验室研究阶段，开发成为生防制剂的较少。主要原因之一是微生物制剂的剂型加工相比化学农药困难。目前，已成功商品化的芽孢杆菌生防制剂有枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌等[6]。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，在其自身的生长过程中可以产生一系列的代谢产物，抑制真菌和细菌的活性[7-14]。因此，解淀粉芽孢杆菌也是近几年芽孢杆菌中的研究热点[15]。但关于其生防菌剂的应用开发发展较晚，2014-04月美国Certis公司才开始销售解淀粉芽孢杆菌杀菌剂产品。在我国，由陕西加仑多作物科学有限公司生产的解淀粉芽孢杆菌生防菌剂于2013-01获得正式农药批号。解淀粉芽孢杆菌在农业上一直作为菌肥使用，其作为生防菌剂在田间的防治效果还有待于检测。本研究采用菌丝生长速率法和孢子萌发法，测定了解淀粉芽孢杆菌对番茄灰霉菌的室内毒力和田间药效，为该药剂应用于田间防治番茄灰霉病提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试药剂：解淀粉芽孢杆菌(1×109CFU/gB.amyloliquefaciens,WP)，陕西加仑多作物科学有限公司生产；枯草芽孢杆菌(1×109CFU/gB.subtilis,WP)，云南星耀生物制品有限公司生产；40%多菌灵(40% carbendazim,WP)，四川国光农化股份有限公司生产；50%异菌脲 (50% iprodione,WP)，江西禾益化工有限公司生产；40%嘧霉胺(40% pyrimethanil,WP)，山东青岛瀚正益农生物科技有限公司生产。

病原菌：番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)，由旱区作物逆境生物学国家重点实验室保藏。

1.2 方 法

1.2.1 无菌药液的制备[16]分别称取药剂1.0 g，加20 mL 20 mmol/L pH 8.0磷酸盐缓冲液于100 mL烧杯中，充分振荡10 min，倒入40 mL离心杯中，8 000 r/min离心15 min，取上清液。沉淀中加入5 mL体积分数100%甲醇(AR)浸泡20 min，减压过滤，取滤液与上清液合并，转入25 mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲液定容至刻度，其中解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的定容液用微孔滤膜(≤0.22 μm)过滤，最终得各药剂的25倍稀释液，即40 mg/mL的无菌工作母液。

1.2.2 番茄灰霉病菌孢子悬浮液的制备 采用孢子萌发法[17]测定5种药剂对番茄灰霉菌孢子萌发的抑制作用。将番茄灰霉病菌在PDA培养基上于22 ℃培养5～7 d，待病原真菌长出大量孢子后，用去离子水从培养基上洗脱、过滤，1 000 r/min离心5 min，倒去上清液，加入去离子水，再离心。最后用质量分数10%蔗糖溶液重悬浮孢子至6×106/mL，调节悬浮液的pH至2。

1.2.3 5种药剂对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制作用 采用菌丝生长速率法[18]测定。在溶化PDA培养基的同时，用移液枪吸取1 mL 2 mg/mL硫酸链霉素于25 mL的无菌刻度管，再在各管中分别加入解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌工作母液1 000，500，250，125，62.5，32 μL，混匀，倒入冷却至60 ℃左右的PDA培养基至20 mL刻度处(相当于将各药液质量浓度再稀释20倍)，迅速摇匀并倒入直径9 cm的培养皿中，制成含不同质量浓度(2 000，1 000，500，250，125，62.5 μg/mL)药剂的平板。同样的方法处理40%多菌灵、50%异菌脲和40%嘧霉胺，制成含不同质量浓度(24，12，6，3，1.5，0.75 μg/mL)药剂的平板。待培养基凝固后，用灭菌的打孔器沿菌落边缘打取直径为6 mm的菌饼，将有菌丝的一侧贴于培养基中心，每皿1片，共3皿。设不加样品液的平皿作空白对照(CK)。22 ℃培养120 h后，观察番茄灰霉病菌菌落的生长情况，用游标卡尺测量菌落直径，精确到0.02 mm，取其平均值，将数据经过转化后进行回归分析，求取各药剂的毒力回归方程、有效抑制中质量浓度(EC50)和相对毒力指数。

1.2.4 5种药剂对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制作用 用移液枪从低质量浓度至高质量浓度，依次吸取用无菌水溶解的药液0.5 mL，分别加入2.0 mL的灭菌离心管中，然后吸取制备好的番茄灰霉病菌孢子悬浮液0.5 mL，使药液与番茄灰霉病菌孢子悬浮液等量混合均匀，配制成含番茄灰霉病菌孢子的200，400，800，1 200和1 600倍稀释药液。用移液枪吸取上述混合液滴到凹玻片上，然后架放于带有润湿滤纸片的培养皿中，于22 ℃的培养箱中加盖保湿培养。每处理3次重复，并设不含药剂的处理为空白对照。培养12 h，空白对照孢子萌发率达到90%以上，检查各处理孢子的萌发情况。光学显微镜下，每处理随机观察5个视野，调查孢子总数不少于300个，分别记录孢子萌发数和孢子总数，将数据经过转化后进行回归分析，求取各药剂的毒力回归方程、有效抑制中质量浓度(EC50)和相对毒力指数。

1.2.5 5种药剂对番茄灰霉病防治的盆栽试验 用清水将5种药剂配制成750，1 000和1 250倍稀释药液。保护性试验：将不同稀释倍数药液均匀喷施于叶面至全部润湿，待叶面药液自然风干24 h后，将番茄灰霉病菌孢子悬浮液喷雾接种于成熟期番茄植株。治疗性试验：将番茄灰霉病菌孢子悬浮液喷雾接种叶面24 h后，将不同稀释倍数药液均匀喷施于叶面至全部润湿。每处理3盆，4次重复，以清水处理为空白对照。接种后移至温室中黑暗条件下培养24 h，然后在22 ℃及12 h光照、12 h黑暗交替条件下培养7 d，分级调查各处理发病情况，每处理至少调查30片叶，计算各处理的病情指数和防治效果。

病情指数分级标准为：0级，无病斑；1级，病斑面积占整个叶面积的5%以下；3级，病斑面积占整个叶面积的≥5%～<15%；5级，病斑面积占整个叶面积的≥15%～<25%；7级，病斑面积占整个叶面积的≥25%～<50%；9级，病斑面积占整个叶面积的50%以上。

(1)

(2)

1.2.6 5种药剂对番茄灰霉病防治的田间试验 将5种药剂的750倍稀释液和清水(对照)以1 050 L/hm2药液量对感染番茄灰霉病的成熟期番茄植株进行喷雾。小区面积15 m2，每处理重复4次，共24个小区，随机区组排列。每小区调查5点，每点3株，调查全部叶片，分级方法同1.2.5。在第1次施药前调查发病基数，3次施药后10 d，调查病情，计算病情指数和防治效果，并对防治效果进行方差分析和多重比较。

(3)

式中：CK0为对照处理前叶片的病情指数，CKn为对照处理后叶片的病情指数；Pt0为药剂处理前叶片的病情指数，Ptn为药剂处理后叶片的病情指数。

2 结果与分析

2.1 5种药剂对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制作用

5种药剂对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制作用如表1所示。由表1可以看出，嘧霉胺和异菌脲对番茄灰霉病菌菌丝生长具有较强的抑制作用，EC50分别为 5.53 和8.95 μg/mL；其次为多菌灵，EC50为75.36 μg/mL；解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制作用较弱，EC50分别为 946.28 和757.19 μg/mL。

2.2 5种药剂对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制作用

5种药剂对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制作用如表2所示。从表2可以看出，嘧霉胺和异菌脲对番茄灰霉病菌孢子萌发具有较强的抑制作用，EC50分别为21.35和37.32 μg/mL；其次为多菌灵，EC50为 241.90 μg/mL；解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制作用较弱，EC50分别为1 665.56和1 416.16 μg/mL。

注：y为抑制率几率值，x为药剂质量浓度的对数值。下表同。

Note:yis the probability value of inhibitory rate,xis the log value of fungicides concentration.The same below.

2.3 5种药剂对番茄灰霉病的盆栽防治效果

由表3可以看出，解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、40%多菌灵、50%异菌脲和40%嘧霉胺稀释750，1 000和1 250倍时，均对番茄叶片灰霉病具有明显的治疗作用和保护作用。以上5种药剂稀释750倍液处理的保护作用最好，防治效果分别为 68.47%，70.14%，74.18%，74.13%和80.63%，其中解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的保护作用显著低于其他3种药剂。

注：同列数据后标不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)。下表同。

Note:Different lowercase letters within the same column represented significant difference (P<0.05).The same below.

2.4 5种药剂对番茄灰霉病的田间防治效果

由表4可以看出，嘧霉胺和异菌脲的750倍液对番茄灰霉病的防治效果较好，分别为75.55%和73.49%，两者之间无显著差异；多菌灵的750倍液防治效果较低，为69.56%；解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的750倍液防治效果均较低，分别为 63.37% 和64.83%，两者无显著性差异但均显著低于其他3种药剂。

3 讨 论

目前，筛选微生物拮抗菌已成为植物病害防治的热点[19-20]。在筛选拮抗菌的过程中，一般采用无菌发酵液对病原菌生长和孢子萌发的有效抑制中浓(EC50)作为室内毒力测定项目，但目前关于生防菌剂产品中生防菌抗菌代谢产物生物效价的测定尚无统一标准[16]。本试验中，2种微生物杀菌剂对番茄灰霉菌菌丝和孢子的EC50值均较大，明显高于化学农药。许彦等[21]研究表明，微生物生防菌剂对植物病原菌的EC50远大于化学农药，主要原因是化学农药的产品标准为有效抑菌物质含量，且有效抑菌物质纯度高，而微生物菌剂产品是以产品中活菌数作为出厂指标，所含的直接抑菌物质含量及纯度均较低。

本研究的盆栽试验中，解淀粉芽孢杆菌的防治效果随着药剂稀释倍数的增大而减小，表明其防效与药剂稀释倍数呈负相关；大田试验中，2种微生物杀菌剂在稀释750倍时的防治效果与3种化学杀菌剂虽然也存在显著差异，但均达到了63.37%以上。这与微生物拮抗菌株产生了拮抗物质，其与病原菌竞争空间和营养、诱导植物产生抗病性、促进植物生长[22]等多种作用机制有关。而2种微生物杀菌剂的防治效果无显著差异，表明解淀粉芽孢杆菌对番茄灰霉病的防治效果与枯草芽孢杆菌相当。

微生物生防制剂在防治植物病害时其田间防效往往不稳定。这是由于生物活体进入自然环境中，受寄主和其他微生物、营养、温度以及水分等各种生物及非生物因素的影响，导致生防微生物很难长时间占有优势并保持功效[23]。解决微生物生防制剂防效不稳定的方法是将其与化学农药复配，一方面可减少化学农药的使用，降低化学药剂残留超标风险；另一方面克服了微生物生防制剂防效不稳定的问题[24]。本试验对解淀粉芽孢杆菌防治番茄灰霉病的效果进行了研究，其与化学农药复配防治番茄灰霉病的效果还有待于进一步研究。

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Toxicity and control efficiency of fungicides againstBotrytiscinerea

HUANG Hai,ZHANG Xin,ZOU Hang,YANG Hai-yan,CAO Jing-jing,AN De-rong

(StateKeyLaboratoryofCropStressBiologyforAridAreas/CollegeofPlantProtection,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 The toxicity ofBacillusamyloliquefacienswettable powder (WP) onBotrytiscinereaand the control effect on tomato gray mold were studied to improve the application ofBacillusamyloliquefaciens.【Method】 The inhibitory effects of five fungicides including 1×109CFU/gB.amyloliquefaciensWP,1×109CFU/gB.subtilisWP,40% carbendazim WP,50% iprodione WP and 40% pyrimethanil WP against tomato gray mold pathogen were determined using hyphae growth rate method and spore germination method,and their control effects were determined in pot and field experiments.【Result】 The 50% effective concentrations (EC50) ofB.amyloliquefaciens,B.subtilis,40% carbendazim,50% iprodione and 40% pyrimethanil against the growth of the hyphae were 946.28,757.19,75.36,8.95 and 5.53 μg/mL,respectively,and their EC50against the germination of conidia were 1 665.56,1 416.16,241.90,37.32 and 21.35 μg/mL,respectively.The control effects of five fungicides (diluted 750 times solution) were 68.47%,70.14%,74.18%,74.13% and 80.63% in pot experiment and 63.37%,64.83%,69.56%,73.49% and 75.55% in field experiment.【Conclusion】 The toxicity and control effectB.amyloliquefaciensWP in field experiment of were equivalent to those ofB.subtilisWP.Therefore,B.amyloliquefaciensWP can be used as assistant biofungicides to control tomato gray mold.

Bacillusamyloliquefacienswettable powder;tomato gray mold;pryinethanil efficacy trials;assistant biofungicides

2013-10-23

高等学校创新引智计划项目(B07049)；国家“863”计划项目(2007AA021503)

黄 海(1987-)，男，贵州兴义人，在读硕士，主要从事微生物资源利用研究。E-mail：yellowsea87@126.com

安德荣(1963-)，男，陕西大荔人，教授，博士生导师，主要从事微生物资源利用和植物病毒学研究。 E-mail：anderong323@163.com

时间:2015-01-05 08:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.02.024

S436.412.1+3

A

1671-9387(2015)02-0184-07

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150105.0859.024.html