胡杨PeSOS1对拟南芥盐诱导H2O2信号途径的调控

王美娟，王 洋，申泽丹，马旭君，撒 刚，邓澍荣，刘丹丹，张玉红，沈 昕，陈少良

(1 北京林业大学 生物科学与技术学院，北京 100083；2 房山区琉璃河镇大陶村委会，北京 102403)

胡杨PeSOS1对拟南芥盐诱导H2O2信号途径的调控

王美娟1，王 洋1，申泽丹1，马旭君1，撒 刚1，邓澍荣1，刘丹丹2，张玉红1，沈 昕1，陈少良1

(1 北京林业大学 生物科学与技术学院，北京 100083；2 房山区琉璃河镇大陶村委会，北京 102403)

【目的】 研究胡杨质膜Na+/H+逆向转运蛋白(SOS1)通过H2O2信号途径对盐胁迫的感知和适应作用。【方法】 克隆胡杨质膜SOS1基因(PeSOS1)，并将其转化到拟南芥中，比较野生型和转PeSOS1基因拟南芥在100 mmol/L NaCl胁迫下的萌发率，根长，干质量，K+、Na+和Ca2+含量，活体植株根尖离子流(K+、Na+和 H+)的流动情况，H2O2的产生和抗氧化酶活性的变化以及抑制剂对根尖离子流的影响，分析100 mmol/L NaCl胁迫下异源表达PeSOS1基因拟南芥与野生型拟南芥耐盐性的差异。【结果】 在NaCl胁迫下，转PeSOS1基因拟南芥株系的萌发率、根长和干质量明显高于野生型拟南芥；转PeSOS1基因拟南芥K+和Ca2+含量也高于野生型拟南芥，而Na+含量较野生型拟南芥低。100 mmol/L NaCl处理后，转PeSOS1基因拟南芥中K+和Na+的平衡(K+/Na+值)与NaCl胁迫前相比下降幅度较小。转PeSOS1基因植株在NaCl胁迫下能更快地产生H2O2，并使抗氧化酶保持较高的活性。SOS1抑制剂阿米洛利(Amiloride)对NaCl胁迫下野生型和转基因拟南芥根尖离子流的变化有明显影响，用质膜NADPH氧化酶抑制剂DPI (抑制H2O2的产生)处理后，转PeSOS1基因拟南芥根尖K+内流减弱，Na+外流和H+内流增强，植株维持K+和Na+平衡的能力减弱。【结论】 在拟南芥中异源表达PeSOS1基因可促进H2O2快速产生，维持了SOS1 mRNA的稳定性，调控了K+和Na+平衡，并激活了抗氧化防御系统，因而显著提高了其耐盐性。

胡杨；盐胁迫；转基因拟南芥；质膜Na+/H+逆向转运蛋白(SOS1)；H2O2信号；K+/Na+平衡；离子流

质膜Na+/H+逆向转运蛋白(SOS1)基因在植物抗盐中的重要作用已广为人知。2007年，Wu等[1]用RACE技术克隆了胡杨SOS1蛋白的基因PeSOS1 (GenBank登录号:DQ517530.1)，其cDNA全长为3 665 bp，包含一个长3 438 bp的开放读码框，编码1 145个氨基酸，理论分子质量为127 ku，预测此蛋白N端有12个跨膜区，其跨膜区与其他植物和微生物高度相似；C端有一个位于胞质内的长亲水性尾巴，其氨基酸序列与拟南芥的质膜Na+/H+逆向转运蛋白(AtSOS1)相似度为64%，在盐胁迫下其蛋白水平会上调，转化到缺失Na+/H+逆向转运蛋白EcNhaA 和 EcNhaB活性的盐敏感大肠杆菌EP432中后，发现可以抑制大肠杆菌对盐的敏感性，提高其耐盐性。抗体定位试验结果证明，PeSOS1定位在质膜上，其功能是将细胞内的Na+排出胞外以避免胞质内过多Na+的积累；盐胁迫下，胡杨叶片中PeSOS1的表达上调，质膜H+-ATPase也同时上调；上调的质膜H+-ATPase可为PeSOS1外排Na+提供动力[2]。Chung等[3]在拟南芥中发现，在盐胁迫下本身不稳定的AtSOS1 mRNA稳定性有所增加，主要是由活性氧介导所致；AtSOS1活性同时受转录后水平的调控[4]。但目前对SOS1和H2O2的相互作用机制尚不清楚。

本试验将胡杨的PeSOS1基因转到拟南芥中，通过实时荧光定量PCR分析不同转基因株系拟南芥中PeSOS1表达量的差异；并利用3个PeSOS1表达量较高的株系进行耐盐性及PeSOS1与H2O2相关性研究，比较野生型拟南芥和转PeSOS1基因拟南芥在盐胁迫下的萌发率、根长、离子含量、根尖离子流、H2O2的产生及相关抗氧化酶活性等指标，以期为探明胡杨PeSOS1响应盐胁迫的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试植物 胡杨为新疆2年生胡杨实生苗，4月份将其栽种在10 L塑料花盆里(1株/盆)，培养基质为土和砂按1∶1体积比混合的基质，置于北京林业大学的苗圃中进行培养，培养期间视天气情况定期浇水和除草，且每隔1周每桶苗木浇1 L Hoagland全营养液。

拟南芥为哥伦比亚生态型(Columbia ecotype,Col-0)，由北京林业大学沈昕实验室留存。培养条件为：温度25/22 ℃(昼/夜)，相对湿度70%，光照强度150 μmol/(m2·s)，光照周期为8 h黑暗/16 h光照。

1.1.2 菌株、质粒与试剂 大肠杆菌TOP10及感受态，由北京林业大学沈昕实验室留存或制备；农杆菌GV3101，购自北京科百奥生物科技有限责任公司；中间载体pENTR/D-TOPO试剂盒(2 580 bp，筛选标记为卡那霉素)，购自Invitrogen公司。植物稳定表达载体pK7m34GW2-8m21GW3D.0 (pK7，15 801 bp，筛选标记为壮观霉素)，由北京林业大学沈昕实验室留存。

rTaqDNA polymerase、ExTaqDNA polymerase，Takara (宝生物工程大连有限公司)生产；Silwet-77，美国GE公司生产；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；Gateway LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix、RNA提取试剂Trizol reagent和逆转录试剂盒 SuperScript®Ⅲ Reverse Transcriptase试剂盒，购自Invitrogen公司；Oligo (dT)15，购自Promega；十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、DEPC、琼脂糖、氨苄青霉素、卡那青霉素和壮观霉素，为Sigma公司生产；胰蛋白胨、酵母提取物，为英国Oxoid公司生产；其他普通国产分析纯试剂为北京化工厂生产。

1.2 方 法

1.2.1 胡杨RNA提取与cDNA 一链的合成 按照Trizol说明书提取胡杨幼嫩叶片的总RNA[2]，用SuperScript®Ⅲ Reverse Transcriptase试剂盒反转录合成cDNA。

1.2.2PeSOS1的克隆 根据胡杨质膜PeSOS1(GenBank登录号:DQ517530.1)的序列，用Primer Primier 5.0软件设计引物(S-P1f：5′-ATGGGGAGCGCGATAGAAACAG-3′，S-P1r：5′-CTAAGAAGCATGATGGAACGAC-3′) 进行PCR扩增。PCR体系为：2.5 μL 10×Taqbuffer，17.5 μL ddH2O，1 μL dNTP mix (10 mmol/L)，引物(S-P1f、S-P1r)各1 μL，1 μL DNA模板，1 μL ExTaqDNA polymerase (5 U/μL)。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸3.5 min，35个循环；72 ℃反应后延伸10 min。用ddH2O代替模板为阴性对照 。

1.2.3 载体的构建PeSOS1测序无误后，用带接头的引物,即CACC+S-P1f和S-P1r扩增PeSOS1，取定量PCR产物按照pENTR/D-TOPO试剂盒说明书直接构建中间载体pENTR/D-TOPO-PeSOS1；反应产物转化大肠杆菌TOP10后铺板，挑单菌落提质粒，鉴定成功后按照Gateway LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix说明书重组pENTR/D-TOPO-PeSOS1与pK7，构建植物表达载体pK7-PeSOS1。利用Primer Primier 5.0软件，设计鉴定检测所用引物S-P2f：5′-AGGATGAGGAACTTGGA-CCTG-3′，S-P2r：5′-CCTGAGGAAATGTAACAC-GGAC-3′，其PCR产物长度约600 bp。PCR反应体系(25 μL)为：ddH2O 18 μL,10×Buffer 2.5 μL,dNTP 1 μL,S-P2f 1 μL,S-P2r 1 μL,DNA 1 μL,rTaqDNA polymerase 0.5 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环30次；72 ℃反应后延伸10 min,然后于10 ℃保存。

1.2.4 拟南芥的转化 将pK7-PeSOS1和空载体pK7 质粒(阴性对照)转化农杆菌GV3101后，用蘸花侵染方法转化拟南芥[5]。用卡那霉素筛选拟南芥转PeSOS1阳性植株，再根据孟德尔分离定律筛选纯合子，用其种子开展后续试验。PCR鉴定时，阳性对照为用质粒pK7作模板进行PCR扩增；阴性对照为用ddH2O作模板进行扩增。

1.2.5 不同拟南芥株系PeSOS1表达量的实时荧光定量PCR (Real Time PCR)分析 取在人工营养土中生长4周并用0和100 mmol/L NaCl处理3 d的野生型(WT)、转空载体(VC)和转PeSOS1基因拟南芥，提取RNA (RNA提取方法同1.2.1)，反转录合成cDNA(方法同1.2.1)，用荧光定量PCR仪(美国 Bio-Rad MJ Opticon 2)进行Real time PCR，检测盐处理对不同株系PeSOS1基因表达量的影响。PCR反应体系(25 μL)为：2.5 μL 10×buffer，17 μL ddH2O，1 μL dNTP mix (10 mmol/L)，引物(S-P3f (5′-GTGAACAGAACGGTGTAGGG-3′)、S-P3r (5′-CGAGTCTCATTTGTGCCTGT-3′)或内参基因Actin的Actin-f (5′-AT-TACCCGATGGGCAAGTCA-3′)、Actin-r (5′-TG-CTCATACGGTCAGCGATAC-3′))各1 μL，DNA Evagreen Green Ⅰ MIX 1 μL，1 μL cDNA模板，0.5 μL rTaqDNA polymerase (10 U/μL)。反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40个循环；72 ℃反应后延伸10 min。以Actin为内参基因，采用2-ΔΔCt方法计算PeSOS1基因的相对表达量。

1.2.6 转基因拟南芥的耐盐性分析 1)盐胁迫对转PeSOS1基因拟南芥萌发率的影响。取野生型和转PeSOS1基因株系拟南芥的T3代纯合子种子，先用质量分数2%次氯酸钠和体积分数75%乙醇无菌消毒处理，再用无菌水洗3次，然后播种在盐浓度分别为0，100和150 mmol/L的1/2 MS培养基上，每天观察并记录其萌发率，至第5 天结束。

2)盐胁迫对转PeSOS1基因拟南芥根长的影响。拟南芥种子萌发3 d后(种子无菌处理方法同上)，在无菌条件下转移到含0和100 mmol/L NaCl的1/2 MS培养基上，为了保证试验处理条件的一致性，需要将种子播在同一培养皿的同一水平线上，且培养皿要垂直放，每1～2 d观察1次，拍照并测量其根长，至第12天结束。

1.2.7 盐胁迫下转基因拟南芥生理指标的变化 1)盐胁迫对拟南芥干质量及K+、Na+、Ca2+含量的影响。野生型与转PeSOS1基因拟南芥种子萌发5 d后，转移至含0,50 和 100 mmol/L NaCl的直径9 cm花盆中，花盆中营养土和蛭石的体积比为1∶1(用PNS营养液泡过夜后使用)，每盆4～6株，每个株系种6盆，覆膜后避光培养2 d后见光，光照3 d后揭膜，培养3周后取地上部分称取鲜质量，杀青后烘干，称干质量，样品粉碎后消煮，用原子吸收分光光度计测定K+、Na+、Ca2+含量，材料培养与处理等参见Wang等[6]的方法。

2)盐胁迫对拟南芥根尖离子流的影响。野生型与转PeSOS1基因拟南芥种子萌发后，均转移至含0和100 mmol/L NaCl的 1/2 MS培养基上生长1或7 d，以0 mmol/L NaCl处理作为对照(CK)，测定K+、Na+、H+流的变化，具体步骤见Wang等[6]和Sun等[7]的方法。因在0 mmol/L NaCl处理培养基上生长1与7 d时根尖离子流的变化趋势一致，因此对照仅列1 d时的结果。

3)SOS1抑制剂阿米洛利(Amiloride)对盐胁迫下拟南芥根尖离子流的影响。野生型与转PeSOS1基因拟南芥种子萌发7 d后，转移至含0和100 mmol/L NaCl的1/2 MS培养基上生长7 d左右，测定K+、Na+、H+流的变化。在含0和100 mmol/L NaCl的1/2 MS液体培养基中，加入100 μmol/L Amiloride处理NaCl胁迫前后拟南芥2 h，再用含100 μmol/L Amiloride的测试液泡30 min，然后测定其K+、Na+、H+流的变化。

1.2.8 盐胁迫下转基因拟南芥根中H2O2的产生及抗氧化酶活性的变化 1)产生H2O2的测定。在1/2 MS培养基上播种无菌处理的拟南芥种子，培养拟南芥无菌组培苗，生长1周时，分别移到含有0 (CK)和100 mmol/L NaCl的1/2 MS固体培养基上(配制培养基时加入相应浓度的NaCl)分别培养10 min，24 h和7 d，利用含50 μmol/L H2O2的探针H2DCFDA避光孵育处理5 min，用1/2 MS液体培养基洗去探针，荧光显微镜(Leica DMI4000 B)下检测其荧光强度并采集图像，用图像处理软件Image Pro-Plus，在根尖上取6～8个点进行检测，计算得到平均荧光强度，以其表示H2O2水平。每个处理取5个样本作重复，以降低个体差异带来的误差。

2)抗氧化酶活性的测定。将野生型和转PeSOS1基因拟南芥种子直接播种在用液体1/2 MS培养基浸泡过夜的培养土中，用保鲜膜覆盖保湿，2 d后照光，3 d后揭膜，每周浇1次1/2 MS液体培养基和2次水，生长4周后，用100 mmol/L NaCl处理3 d后采样，将样品立即置于液氮中保存。

超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑(Nitro Blue Tetrazolium chloride,NBT)比色法，参考Giannopolitis 等[8]和Wang等[9]的方法进行。谷胱甘肽还原酶(GR)活性根据NADPH的氧化反应来测定，具体参考Giannopolitis等[8]和Schaedle[10]的方法进行。过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸氧化酶(APX)活性测定参考Wang等[6,8]的方法进行。

1.2.9 H2O2对盐诱导拟南芥根尖离子流的调控 用DPI (NADPH氧化酶的抑制剂)处理拟南芥，测定根尖K+、H+、Na+流的变化情况，研究H2O2对盐诱导根尖离子流的调控作用。

取生长1周的拟南芥组培苗，其中野生型和转PeSOS1基因拟南芥均设4个处理：第Ⅰ组为阴性对照，在测试液(含0.1 mmol/L NaCl、0.1 mmol/L MgCl2、0.1 mmol/L CaCl2、0.5 mmol/L KCl和25 g/L蔗糖，用HCl和KOH调节pH至5.5)中适应0.5 h后，直接测定K+、Na+、H+流；第Ⅱ组为阳性对照，在含100 μmol/L DPI的1/2 MS液体培养基中处理2 h后，再在测试液中适应0.5 h，测定K+、Na+、H+流；第Ⅲ组：在含100 mmol/L NaCl的1/2 MS液体培养基中处理2 h后，再在测试液中适应 0.5 h，然后测定K+、Na+、H+流；第Ⅳ组：在含100 mmol/L NaCl和100 μmol/L DPI的1/2 MS液体培养基中处理2 h后，在测试液中适应0.5 h，测定K+、Na+、H+流。以上4个处理分别简称为CK、DPI、NaCl和NaCl+DPI。

2 结果与分析

2.1 胡杨RNA提取与cDNA一链的合成

由图1可见，提取的胡杨RNA条带清晰，且28S条带的亮度约为18S的2倍，基本无蛋白、盐离子和DNA等杂质污染， OD260/OD280约为2.0，OD260/OD230约为2.0，说明RNA质量和完整度好，纯度高。cDNA 一链经电泳检测发现，条带呈弥散状，分子质量在1～2 kb(图2)，说明cDNA质量很好，完全能满足下一步试验需要。

2.2 胡杨PeSOS1的克隆

PeSOS1的PCR扩增结果见图3。图3显示，克隆条带单一清晰，无非特异性条带，大小为3 000～4 000 bp，符合预期长度。经测序鉴定发现,拼接序列与Wu等[1]克隆的PeSOS1(GenBank登录号:DQ517530.1)的大小及序列完全一致。

图2 胡杨cDNA一链的电泳结果
1．DNA Marker DL2000；2.cDNA一链产物；3.DNA Marker DL10000
Fig.2 Gel electrophoresis ofPopuluseuphraticacDNA
1.DNA Marker DL2000;2.cDNA;3.DNA Marker DL10000

图3 胡杨PeSOS1的PCR扩增结果1～3.PeSOS1的扩增产物；4.DNA Marker DL10000；5.阴性对照
Fig.3 PCR amplification ofPopuluseuphraticaPeSOS1 gene1-3.PCR product ofPeSOS1;4.DNA Marker DL10000;5.Negative control

2.3 转PeSOS1载体的构建

图4-A显示，构建的中间载体pENTR/D-TOPO-PeSOS1的大小为3 000 bp。对构建的中间载体pENTR/D-TOPO-PeSOS1进行PCR鉴定，结果(图4-B)显示，该载体构建成功。

由图5可知，表达载体pK7-PeSOS1的PCR产物大小为3 000 bp左右，符合预期的PCR产物(PeSOS1的全长)大小。

2.4 拟南芥的转化

转化拟南芥后，顺利获得了7个阳性株系，标记为S1～S7，从中选取PeSOS1表达量高的3个株系(S1、S2和S5)进行纯合子筛选及耐盐性试验。转PeSOS1拟南芥阳性植株的基因组DNA见图6。

图6 转PeSOS1拟南芥阳性植株的基因组DNA
1.DNA Marker DL15000；2～6.不同转基因株系
Fig.6 Gel electrophoresis of genetic DNA of transgenicArabidopsislines
1.DNA Marker DL15000;2-6.Different transgenic lines

由图6可知，拟南芥T1代阳性株系的DNA提取结果完好，条带单一，既没有降解，也没有RNA的污染，完全可以用作模板进行定性鉴定。图7显示，从拟南芥T1代阳性株系中全部成功鉴定出了目的条带，且条带大小与用质粒pK7作模板的阳性对照一致，野生型拟南芥和阴性对照中均没有此条带，说明卡那霉素筛选结果可靠，转基因株系鉴定成功。

2.5 不同株系拟南芥PeSOS1表达量的实时荧光定量PCR分析

野生型和转PeSOS1基因拟南芥的RNA及PCR扩增结果见图8。

由图8-A可知，野生型和转PeSOS1基因拟南芥的RNA提取较为成功，没有降解及基因组DNA的污染，条带28S的亮度约为18S的2倍，说明RNA质量较高，其OD280/OD260、OD280/OD230值均为1.8～2.0，说明样品RNA的质量完全满足后续试验要求。图8-B显示，转PeSOS1基因拟南芥扩增条带单一，亮度良好，没有非特异性条带及引物二聚体的污染。目的模板扩增片段清晰可见，阴性对照(VC)没有目的条带的痕迹，可以满足实时荧光定量PCR的要求。

通过检测不同株系拟南芥PeSOS1的表达量(图9)发现，在野生型拟南芥和转空载体pK7植株中均未检测到PeSOS1基因，而转基因拟南芥中均检测到PeSOS1。当用0 mmol/L NaCl处理后，转基因拟南芥中PeSOS1表达量均不高，而用100 mmol/L NaCl处理后转基因株系PeSOS1表达量显著提高。

2.6 转基因拟南芥的耐盐性

NaCl胁迫对野生型和转PeSOS1基因拟南芥萌发率的影响见图10。图10表明，在无盐(0 mmol/L NaCl)培养基上，野生型(WT)和转PeSOS1基因拟南芥(S1、S2、S5)的萌发率较高，均在95%左右；当用100 mmol/L NaCl处理后，转PeSOS1基因拟南芥的萌发率基本没有明显变化，为70%～90%，而野生型拟南芥萌发率却降到了30%左右；在用150 mmol/L NaCl处理后，野生型拟南芥的萌发率降到了约10%，而转PeSOS1基因拟南芥株系中的萌发率显著高于野生型拟南芥。说明转PeSOS1基因后植株的耐盐性显著提高。

观察发现，处理7 d后，在无盐(0 mmol/L NaCl)培养基上，野生型和转PeSOS1基因拟南芥株系的根长没有差异(图11)，同时植株在叶片和根形态上也没有差异；利用100 mmol/L NaCl处理后，转基因株系的根长生长优于野生型(图11)，且转基因株系叶片较大、绿色较深，根比较粗壮，说明盐胁迫并没有明显抑制转PeSOS1基因株系根长的生长，却抑制了野生型拟南芥根长的生长。

监测长期(6～12 d)盐胁迫下野生型和转PeSOS1基因拟南芥的根长生长，结果见图12。由图12可知，在无盐(0 mmol/L NaCl)培养基上，野生型与转PeSOS1基因株系拟南芥的根长在胁迫6～10 d时差异不显著，但在12 d时差异显著。用100 mmol/L NaCl处理后，其抑制了拟南芥的根长生长，且对野生型拟南芥的抑制作用更为明显，转PeSOS1基因株系拟南芥的根长生长显著优于野生型，

说明转PeSOS1基因拟南芥生长受盐胁迫的影响较小。

2.7 盐胁迫下转基因拟南芥生理指标的变化

2.7.1 盐胁迫对干质量及K+、Na+、Ca2+含量的影响 图13显示，当NaCl浓度为0 mmol/L时，转PeSOS1基因拟南芥与野生型拟南芥的干质量差异不显著。用50～100 mmol/L NaCl处理后，野生型拟南芥的干质量显著下降，且随着NaCl浓度的增加，下降幅度更明显；转PeSOS1基因拟南芥干质量亦有所下降，但下降幅度低于野生型拟南芥，说明转PeSOS1基因拟南芥的生物量受盐胁迫的影响明显小于野生型拟南芥。

图14显示，NaCl处理前野生型与转PeSOS1基因拟南芥的K+含量没有显著差异，100 mmol/L NaCl处理后野生型植株的K+含量下降了约50%，而转PeSOS1基因株系K+含量虽然也有所下降，但下降幅度较小，为NaCl处理前的80%～90%，说明转PeSOS1基因拟南芥在盐胁迫下能更好地抑制K+的流失。100 mmol/L NaCl处理后，野生型拟南芥比转基因株系积累了更多的Na+，约为处理前的2倍；转PeSOS1基因株系Na+含量也有所增加，但其增加幅度较小，约为NaCl处理前的10%。NaCl处理前后转PeSOS1基因拟南芥Ca2+含量变化趋势与K+相似，即NaCl处理前，野生型与转PeSOS1基因拟南芥Ca2+含量无显著差异；100 mmol/L NaCl处理后，野生型拟南芥Ca2+含量显著下降，而转PeSOS1基因拟南芥Ca2+含量基本上维持了原有的水平，与NaCl处理前差异不显著。说明转PeSOS1基因拟南芥在盐胁迫下营养元素的流失减少。100 mmol/L NaCl处理后，野生型拟南芥的K+/Na+明显下降，其K+/Na+失去平衡，对植株的生长造成较大影响，而转PeSOS1基因拟南芥能有效减少K+和Ca2+的流失，因此受盐胁迫的伤害较轻。可知100 mmol/L NaCl处理后转PeSOS1基因拟南芥对K+/Na+平衡的维持能力比野生型拟南芥强。

2.7.2 盐胁迫对根尖离子流的影响 图15显示，在非盐胁迫下(用0 mmol/L NaCl处理1 d，CK，下同)，野生型和转PeSOS1基因拟南芥K+流没有显著差异；100 mmol/L NaCl处理后野生型和转PeSOS1基因株系K+内流均有所减少，短期(1 d)盐处理后转PeSOS1基因拟南芥的K+内流显著大于野生型；在长期(7 d)盐胁迫下，野生型拟南芥还出现了K+外流的情况，而转PeSOS1基因拟南芥没有出现K+外流的情况，说明转PeSOS1基因拟南芥在盐胁迫下仍能保持对K+的吸收，而野生型拟南芥在长期盐胁迫下则出现了K+外流。

由图15还可见，在非盐胁迫下，转PeSOS1基因拟南芥Na+外流高于野生型，但差异不显著。100 mmol/L NaCl处理1 d后，不同株系拟南芥Na+外流均增加，但是转PeSOS1基因拟南芥Na+的外流显著高于野生型；处理7 d后，不同株系拟南芥Na+外流进一步增加，但转PeSOS1基因拟南芥的Na+外流仍显著高于野生型拟南芥。

由图15可以看出，在非盐胁迫下，转PeSOS1基因拟南芥H+外流与野生型差异不显著，但用100 mmol/L NaCl处理后，无论是短期(1 d)还是长期(7 d)盐胁迫，均能导致拟南芥出现H+内流，且野生型拟南芥的H+内流显著小于转基因株系，说明转PeSOS1基因拟南芥能及时对盐处理作出响应，激活SOS1蛋白，外排Na+的同时将H+转运到胞内，使得H+呈内流的趋势。

2.7.3 抑制剂Amiloride对NaCl胁迫下根尖离子流的影响 图16显示，抑制剂Amiloride处理与否，对照组(CK)中不同株系拟南芥的K+内流差异不显著；但在100 mmol/L NaCl胁迫组中，添加Amiloride后，其明显抑制了转PeSOS1基因株系的K+内流，转PeSOS1基因株系K+内流与野生型拟南芥没有显著差异。这说明盐胁迫下转PeSOS1基因拟南芥与野生型拟南芥的K+流与SOS1活性的关系密切。

图16表明，添加Amiloride与否，对照组(CK)中转PeSOS1基因拟南芥的Na+外流与野生型拟南芥无显著差异。用NaCl处理后，转PeSOS1基因拟南芥的Na+外流高于野生型拟南芥，且差异显著；用NaCl+Amiloride处理后，转PeSOS1基因拟南芥和野生型拟南芥Na+外流均大幅减小，且转基因拟南芥与野生型没有显著差异。说明抑制剂Amiloride处理后消除了PeSOS1对Na+外流的促进作用。

由图16还可知，添加Amiloride与否，对照组中不同株系拟南芥H+外流差异不显著。NaCl处理后，使H+流向发生变化，由外流转变为内流，这与Na+的外流相对应，表明为Na+/H+逆向转运。NaCl+Amiloride处理后，不同株系的H+内流均大幅度降低，且野生型和转PeSOS1基因株系间的差异消失，说明SOS1被抑制后，Na+/H+逆向转运受到明显影响。

2.8 盐胁迫下转基因拟南芥根中H2O2的产生和抗氧化酶活性的变化

图17显示，拟南芥根细胞产生的H2O2随着NaCl胁迫时间的延长而增加，但变化趋势有所不同。野生型拟南芥的H2O2随着盐胁迫时间的延长而逐渐增加，至第7天H2O2水平达到最高；而转PeSOS1基因拟南芥根细胞中H2O2水平在24 h内呈增加的趋势，之后到第7天并未继续增加，与NaCl处理24 h的水平基本一致。说明转PeSOS1基因拟南芥能及时抑制H2O2的过量产生，避免过多的活性氧带来的氧化胁迫，而野生型拟南芥并不能抑制盐诱导的H2O2过量产生。

图18表明，在转PeSOS1基因拟南芥和野生型拟南芥中，抗氧化物酶SOD和GR活性在NaCl胁迫前后的变化趋势基本相同，即NaCl处理前转PeSOS1基因拟南芥与野生型拟南芥SOD和GR活性无显著差异，NaCl胁迫后SOD和GR活性均增加，但是转PeSOS1基因拟南芥SOD和GR活性增加的幅度显著大于野生型拟南芥。野生型拟南芥的CAT和APX活性受NaCl胁迫的影响小，而转PeSOS1基因拟南芥在NaCl胁迫后CAT和APX活性均显著提高，且APX活性平均提高幅度(100%)高于CAT(30%)。

2.9 H2O2对盐诱导转基因拟南芥根尖离子流的调控

图19显示，与CK相比，NaCl处理后拟南芥根尖的K+内流减弱，Na+外流和H+内流增强，表明Na+/H+逆向转运能力提高。与野生型拟南芥相比，转PeSOS1基因拟南芥K+内流减弱的幅度较小，Na+外流和H+内流的增强幅度均较大，Na+/H+逆向转运能力较高，且野生型与转PeSOS1基因型拟南芥差异显著。与CK相比，加入NADPH氧化酶抑制剂DPI后，不同株系拟南芥根尖的离子流未受影响，但却进一步降低了NaCl处理拟南芥根尖的K+和H+的内流。与CK相比，NaCl和DPI共同处理后野生型和转PeSOS1基因拟南芥Na+外流均有所增加，但是野生型拟南芥增幅较少，说明DPI对NaCl处理后野生型拟南芥的影响比转PeSOS1基因拟南芥大，可能是由于野生型拟南芥在NaCl处理后产生了较多H2O2所致；说明添加DPI抑制了H2O2的产生后，影响了离子的平衡，降低了转PeSOS1基因拟南芥Na+外流与野生型拟南芥的差异，即减小了转PeSOS1基因造成的差异。与NaCl处理相比，NaCl和DPI共同处理后，转PeSOS1基因拟南芥和野生型拟南芥H+内流均减小，而野生型拟南芥减少幅度较转PeSOS1基因拟南芥小。可知NaCl与DPI共同处理后，转PeSOS1基因拟南芥与野生型拟南芥根尖离子流之间的差异比NaCl单独处理造成的差异有所降低。以上结果表明，H2O2调节了SOS1的活性，参与盐诱导离子流的调控。

3 讨 论

SOS1在提高植物抗盐性中有着非常重要的作用。质膜SOS1外排Na+的作用降低了植物因盐处理导致的体内Na+积累，因此减少了Na+积累带来的离子渗透和氧化胁迫作用[11-12]，进而保证了K+、Ca2+等重要离子所占的比例，维持了K+/Na+平衡[12-14]，这为植物细胞内的正常代谢等生命活动提供了必要条件。SOS1在作为离子转运体的同时还兼顾了信号信使的重要使命[15-18]。盐胁迫产生的H2O2也起着信号信使的作用[2,19]。NaCl处理植物后，SOS1和H2O2信号系统共同作用，调控着植物体对NaCl胁迫的适应性[8,20]。对胡杨根组织分离原生质体的研究发现，耐盐性的胡杨在盐处理后维持了K+/Na+平衡，且在此过程中，SOS1保持着对Na+的外排活性[20]。与对盐敏感的杨树相比，胡杨的叶片组织在盐处理或正常生长状态下均可保持较高的SOS1转录水平[2]。本研究克隆并表达了PeSOS1，发现PeSOS1可显著增强转基因拟南芥植株的耐盐性和K+/Na+平衡。

前人在多种植物中均发现，盐和H2O2均对SOS1 mRNA的稳定性起着重要作用[3,21]。本研究发现，短期(10 min～24 h)NaCl胁迫下转PeSOS1基因的拟南芥根细胞中 H2O2水平显著高于野生型拟南芥，而且H2O2在多种类型细胞中均对刺激生长起到重要作用[6,21-24]，这可能是转PeSOS1基因拟南芥在盐胁迫下根系快速生长的原因。

Amiloride和DPI分别是SOS1和质膜NADPH氧化酶的抑制剂，在转基因植株中Na+外流和K+内流受Amiloride和DPI的影响。说明拟南芥可能通过H2O2来调控SOS1，以达到维持胞内K+/Na+平衡的作用[25]。很多研究已经证明，H2O2对SOS1的活性有调节作用[3,25]。Sun等[26]研究表明，在胡杨细胞中，NaCl诱导产生的H+内流有助于产生过量的H2O2[26]。因此可以推测，由于H+内流的加强，导致质外体瞬时碱化，可激活质膜NADPH氧化酶并导致转基因拟南芥根细胞中H2O2的积累[27]。这可能是因为NaCl处理后PeSOS1表达上调，使植物在外排Na+的同时将大量H+转入胞内，这有助于激活质膜NADPH氧化酶，从而调节H2O2的产生。

在本研究中，转PeSOS1基因拟南芥在NaCl处理下快速产生H2O2，且胁迫早期(10 min～24 h)H2O2的爆发可引起抗氧化防御[20,28]。本研究发现，转PeSOS1基因拟南芥在有或无NaCl处理的条件下均可保持较高的抗氧化酶活性，这使得H2O2水平得到了控制。研究表明，盐胁迫下胡杨能调控活性氧平衡主要通过2条途径：一是控制胞内离子平衡来减少长期盐胁迫下诱导的活性氧产生，二是迅速上调氧化防御机制来阻止活性氧的损伤[20,29]。胡杨在盐胁迫前后其PeSOS1均有较高的表达量[2]。本试验结果表明，NaCl胁迫后，转PeSOS1基因拟南芥中H2O2迅速产生，从而有助于通过调控Na+/H+逆向转运系统的活性以维持K+/Na+平衡；此外，H2O2还能上调氧化防御机制从而防止长期NaCl胁迫下的氧化损伤发生。另外，盐诱导H2O2提高胞内Ca2+浓度，胞内Ca2+信号通过SOS信号通路激活SOS1[30]。在拟南芥中，H2O2对维持SOS1 mRNA的稳定性还有重要作用[3]。因此可以推断，在拟南芥和胡杨中SOS1的高量表达促进了盐胁迫下H2O2的产生，H2O2信号网络进一步调控胞内的离子平衡。

综上所述，在拟南芥中异源表达PeSOS1后，转基因植株的耐盐性提高，其机制为通过上调Na+/H+逆向转运蛋白活性及外排Na+维持了K+/Na+平衡；同时转PeSOS1基因拟南芥通过促进H2O2的产生，又进一步维持了SOS1 mRNA的稳定性，使之在长期盐胁迫中保持活性，从而对植物的生长起着重要的作用。

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Modulation of H2O2signaling in salt-stressedArabidopsisbyPeSOS1

WANG Mei-juan1,WANG Yang1,SHEN Ze-dan1,MA Xu-jun1,SA Gang1,DENG Shu-rong1,LIU Dan-dan2,ZHANG Yu-hong1,SHEN Xin1,CHEN Shao-liang1

(1CollegeofBiologicalSciencesandTechnology,BeijingForestryUniversity,Beijing100083,China;2DataoVillageofColouredGlazeRiverTown,FangshanDistrict,Beijing102403,China)

【Objective】 This study aimed to investigate the role ofPeSOS1 in salt sensing and adaption through H2O2signaling.【Method】 Plasma Membrane (PM) Na+/H+antiporter genePeSOS1 ofPopuluseuphraticawas cloned and introduced toArabidopsisthaliana.Then differences in salt tolerance between wild-type andPeSOS1-transgenicArabidopsisplants were illustrated by comparing germination,root length,biomass,contents of K+,Na+and Ca2+,fluxes of root K+,Na+and H+,H2O2production,antioxidant enzyme activity and effects of inhibitor on ion fluxes of homozygous seedlings under 100 mmol/L NaCl salt stress.【Result】 Compared to wild-type,PeSOS1-transgenicArabidopsisplants had higher germination rate,root length,and biomass under NaCl stress.PeSOS1-transgenicArabidopsisplants also had higher contents of K+and Ca2+but lower content of Na+.Transgenic plants exhibited lower ratio of Na+/H+antiport compared to wild-type.In roots of transgenicArabidopsis,H2O2production was more rapidly than wild-type when plants were subjected to NaCl stress and the activities of the antioxidant enzymes were higher.Transgenic plants were unable to remain K+/Na+homeostasis when salt-induced H2O2production was inhibited by diphenylene iodonium (DPI),an inhibitor of NADPH oxidase.【Conclusion】PeSOS1 increased salt tolerance through rapid H2O2production,which maintained the stability of SOS1 mRNA,controlled K+/Na+homeostasis and triggered antioxidant defense inArabidopsis.

Populuseuphratica;salt stress;transgenicArabidopsis;PM Na+/H+antiporter (SOS1);H2O2signaling;K+/Na+homeostasis;ion flux

2013-10-25

国家自然科学基金项目(31270654，31170570)；教育部科学技术研究项目(113013A)；北京市自然科学基金项目(6112017)；中央高校基本科研业务费专项(JC2011-2，TD-2012-04)；北京市优秀博士学位论文指导教师专项(YB20081002201)；高等学校学科创新引智计划项目(111 Project，B13007)

王美娟(1983-)，女，山东济宁人，博士，主要从事树木抗逆生理与分子生物学研究。E-mail：colorhail@sina.com

陈少良(1969-)，男，河北霸州人，教授，博士生导师，主要从事林木抗逆生理与分子生物学研究。 E-mail：Lschen@bjfu.edu.cn

时间:2015-01-05 08:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.02.009

S792.119;Q785

A

1671-9387(2015)02-0079-13

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150105.0859.009.html