基因枪介导的转PYL5基因小麦的获得与鉴定

池 青， 周 鹏，刘香利,，程绘绘，赵惠贤,

(西北农林科技大学 a 生命科学学院，b 旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西 杨凌 712100)

基因枪介导的转PYL5基因小麦的获得与鉴定

池 青a， 周 鹏b，刘香利a,b，程绘绘a，赵惠贤a,b

(西北农林科技大学 a 生命科学学院，b 旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西 杨凌 712100)

【目的】 通过基因枪介导共转化，获得转拟南芥抗旱基因PYL5的小麦植株，为转基因小麦的抗旱功能研究奠定基础。【方法】 以小麦品种西农889、绵阳19和宁春16为供试材料，通过基因枪介导法将诱导型启动子Rd29A启动的PYL5基因和筛选标记基因Bar共转化到小麦幼胚愈伤组织中，经过除草剂PPT(Phosphinothricin)筛选和愈伤组织分化，获得再生植株。根据目标基因PYL5和Bar基因序列分别设计特异引物，对移栽成活的小麦T0代再生植株进行基因特异性PCR检测。【结果】 采用基因枪分别轰击西农889的1800个、绵阳19的800个和宁春16的800个幼胚愈伤组织，经过筛选和分化分别获得了9，5和14株小麦再生植株；对转基因小麦T0代再生植株的基因特异性PCR检测结果表明，西农889、绵阳19和宁春16Bar基因的转化率分别为0.280%，0.500%和0.750%，PYL5基因的转化率分别为0.110%，0.125%和0.500%，Bar和PYL5基因的共转化率分别为0.110%，0.125%和0.500%。【结论】PYL5基因成功转入到了小麦品种西农889、绵阳19和宁春16中。

小麦；基因枪法；共转化法；PYL5基因

小麦是世界上重要的粮食作物之一。目前，世界上小麦播种面积的70%分布于干旱和半干旱地区[1]。在各种非生物胁迫中，干旱已经成为限制小麦产量的主要因素之一[2]。因此，培育抗旱小麦品种是提高小麦总产量和缓解世界粮食安全问题的重要途径。

迄今为止，我国小麦育种者通过传统育种方法已经培育出一大批抗旱小麦品种，为提高我国小麦产量做出了重要贡献。但是传统的遗传改良方法育种周期较长，而且很难使小麦抗旱性有很大程度的提高。近年来，随着生物技术的不断发展，利用基因工程方法定向改良小麦的性状已经成为传统育种方法的有效补充。目前，利用植物基因工程改良方法已经成功获得了抗病[3-5]、抗虫[6-7]、抗逆[8]、品质改良[9-10]、高产量[11-12]等小麦转基因品种或品系。通过将一些具有抗旱功能的基因转入到植物体内，可使转基因植物的抗旱性有一定程度的提高。Pellegrineschi等[13]采用基因枪介导法，将拟南芥的DREB1A基因导入普通小麦品种Bobwhite 26中发现，转基因植株的耐旱性有了明显的提高。Hmida-Sayari等[14]从拟南芥中克隆出了Δ′-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因，并通过农杆菌介导法将其转入到马铃薯中，发现在高盐胁迫条件下转基因马铃薯的生长状况明显优于对照，且转基因植株体内的脯氨酸含量有明显的积累。He等[15]采用农杆菌介导法，将大肠杆菌胆碱脱氢酶基因(betA)转到小麦品种济南17号中，发现转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性均升高，而丙二醛含量降低，植株根长和生长情况明显优于对照。

脱落酸(ABA)是植物体内最重要的5大生长激素之一，有促进气孔关闭、水分吸收及降低叶片伸展率、调节保卫细胞离子通道等重要的生理功能，对于保护植物在逆境中的生长具有至关重要的作用[16-17]。PYL5基因是从拟南芥中克隆出来的编码PYL蛋白的基因，PYL蛋白是ABA信号转导途径中的ABA受体蛋白，它通过与ABA的结合来抑制2C类丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C)的活性，使ABA信号途径向下传递，进而提高植物的抗旱性[18-20]。拟南芥Rd29A启动子是逆境诱导型启动子，该启动子含有2个干旱、低温和高盐响应顺式作用元件，可被干旱、高盐、低温诱导表达，在逆境胁迫的早期，这些顺式作用元件被诱导表达，从而激活靶基因的表达，增强转基因植株的抗逆性[21]。目前, 尚无关于利用PYL5基因进行小麦遗传转化及提高小麦抗旱性的研究报道。

本研究构建了由Rd29A驱动的PYL5植物表达载体；采用基因枪共转化方法，将目标基因PYL5和筛选标记基因Bar转入弱冬性小麦品种西农889、春小麦品种绵阳19和宁春16的幼胚愈伤组织中，通过除草剂PPT(Phosphinothricin)筛选和愈伤组织的分化，获得了含有目的基因PYL5的转基因小麦植株，以期为进一步研究转PYL5基因小麦的遗传稳定性及转基因小麦的抗旱性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料与载体质粒

选用小麦品种西农889、绵阳19和宁春16为材料，于2011-2013年小麦生长季节将其种植在西北农林科技大学小麦试验田，正常管理。共转化所用载体质粒分别为含有目标基因PYL5的载体质粒pRd29A::PYL5和含有筛选标记基因Bar的载体质粒pUBI::Bar。pRd29A::PYL5和pUBI::Bar的结构见图1。

1.2 小麦遗传转化和转基因植株的获得

采集西农889、绵阳19和宁春16开花10 d后的未成熟种子，利用质量分数0.1%升汞和体积分数75%乙醇消毒后，剥取幼胚并将其盾片朝上接种于MS诱导培养基(MS+500 mg/L 酸水解酪蛋白+2.0 mg/L 2,4-D)上，25 ℃暗培养7 d后转入高渗培养基(MS+0.4 mol/L 甘露醇+500 mg/L 酸水解酪蛋白+2.0 mg/L 2,4-D)，25 ℃暗培养6 h，然后采用Bio-Rad公司生产的PDS-1000/He型基因枪进行轰击(金粉用量为120 μg/枪，含筛选基因Bar和目标基因PYL5，这2种质粒浓度比为1∶1，用量均为1.0 μg/枪，轰击压力为1 100 psi，真空度为27～28 Pa，轰击距离为9 cm)。将轰击后的愈伤组织置于高渗培养基上25 ℃继续培养16 h，再转移到MS诱导培养基上恢复培养2周。将恢复培养后的愈伤组织转移至MS+PPT的分化筛选培养基(西农889：MS +500 mg/L 酸水解酪蛋白+4.0 mg/L KT+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+ 4.0 mg/L PPT+30 g/L蔗糖+7.0 g/L琼脂；绵阳19：MS +500 mg/L 酸水解酪蛋白+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L IAA+5.0 mg/L PPT+30 g/L蔗糖+7.0 g/L琼脂；宁春16:MS+500 mg/L 酸水解酪蛋白+4.0 mg/L KT+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L PPT+30 g/L蔗糖+7.0 g/L琼脂)上，在温度为25 ℃、照度为5 000 lx的光照条件下培养，每2周更换1次培养基，将分化出的小苗转移至生根培养基(1/2 MS+0.2 mg/L NAA)中，待苗高为4～5 cm时移至春化间(4 ℃)春化20～40 d，至小苗株高为7～8 cm时将根系发达的分化苗移栽到培养钵(直径30 cm、高度50 cm)中，于温室内生长。

1.3 转基因小麦T0代植株的基因特异性PCR(AS-PCR)检测

取转基因植株幼嫩叶片，采用CTAB法[22]提取基因组DNA，根据Rd29A+PYL5基因序列设计特异引物进行PCR扩增。上游引物为：5′-GCAACT-CCAACACGGCTCAG-3′，下游引物为：5′-CATCAACGATGTAAGACTCCACCA-3′；预期扩增片段大小为500 bp左右。Bar基因PCR扩增检测的上游引物为：5′-TGCACCATCGTCAACCACTACAT-3′,下游引物为：5′-GCTGCCAGAAACCCACGTCAT-3′,预期扩增片段长度为433 bp。PCR扩增体系总体积为20 μL：10×PCR buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，上、下游引物(稀释成10 μmol/L)各0.5 μL，TaqDNA聚合酶 0.2 μL (TianGen公司)，模板DNA约200 ng，补ddH2O至20 μL。Rd29A+PYL5的扩增程序为：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。Bar的扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。以非转基因植株为阴性对照，ddH2O为空白对照，将扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

2 结果与分析

2.1 转基因小麦植株的获得

用含目标基因PYL5与筛选标记基因Bar的表达载体对西农889(1 800块幼胚愈伤组织)、绵阳19(800块幼胚愈伤组织)和宁春16(800块幼胚愈伤组织)分别进行共转化。3个品种部分愈伤组织的诱导和筛选分化结果如图2所示，愈伤组织转化和再生植株统计结果见表1。对基因枪轰击后的西农889、绵阳19和宁春16愈伤组织经过恢复培养和筛选分化，分别获得9，5和14株小麦再生植株(表1)。

2.2 转基因小麦T0代再生植株的AS-PCR鉴定

将经过PPT筛选的转基因小麦再生植株移栽到温室培养，取嫩叶提取基因组DNA进行AS-PCR检测。经过多次AS-PCR检测，非转基因植株(阴性对照)和ddH2O(空白对照)中均没有扩增产物。西农889转化得到的9株再生植株中有5株(A4～A8再生植株)扩增到与阳性质粒pUBI::Bar长度一致的433 bp的目标片段(图3-A左)，表明这5株为转Bar基因的阳性植株，Bar基因转化率为0.280%(5/1 800)；此外，这9株再生植株中有2株(A4和A6)扩增到与阳性质粒pRd29A::PYL5长度一致的500 bp左右的目标片段基因(图3-A右)，表明这2株为转PYL5基因的阳性植株，PYL5的转化率为 0.110%(2/1 800)。因本试验采用Bar基因抗性进行筛选，得到的转目标基因的阳性植株均为Bar基因阳性植株，即共转化率与目标基因的转化率一致。由图3-A可知，A4和A6再生植株同时转入了PYL5和Bar基因，共转化率为 0.110%。

将经过PPT筛选的5株绵阳19再生植株移栽到温室，取样进行AS-PCR检测。有4株(B4～B7再生植株)扩增到与阳性质粒pUBI::Bar长度一致的433 bp的目标片段(图3-B左)，Bar基因转化率为0.500%(4/800)；5株再生植株中有1株(B4再生植株)扩增到与阳性质粒pRd29A::PYL5长度一致的500 bp左右的目标基因片段(图3-B右)，PYL5转化率为0.125%(1/800)。 由图3-B可知，B4再生植株同时转入了PYL5和Bar基因，共转化率为0.125%。

经过PPT筛选，宁春16共得到14株再生植株，取样进行AS-PCR检测发现，有6株(C4～C9再生植株)扩增到与阳性质粒pUBI::Bar长度一致的433 bp的目标片段(图3-C左)，表明这6株为转Bar基因的阳性植株，Bar基因转化率为0.750%(6/800)；14株再生植株中有4株(C4、C5、C8和C9再生植株)检测到与阳性质粒pRd29A::PYL5长度一致的500 bp左右的扩增片段(图3-C右)，表明这4株为转PYL5基因的阳性植株，PYL5转化率为0.500%(4/800)。 由图3-C可知，C4、C5、C8和C9再生植株同时转入了PYL5基因和Bar基因，共转化率为0.500%。

3 讨 论

根据启动子的转录模式可以将其分成3类：组织特异性启动子、组成型启动子和诱导型启动子[23]。在植物基因工程改良研究的初期，多采用组成型启动子启动目的基因的高效和非特异性表达，但是这种表达模式不仅会造成植物体内能量的过度消耗，还有可能造成基因沉默现象[24-25]。因此，现在的研究者多采用组织特异性启动子或诱导型启动子来代替组成型启动子。

目前，已有许多关于诱导型启动子Rd29A应用在植物转基因研究中的报道，高世庆等[26]将Rd29A启动子控制GUS报告基因的表达载体，通过基因枪介导法转化到小麦的幼胚愈伤组织中，在PEG胁迫条件下进行GUS组织化学染色，证实了Rd29A启动子能在小麦愈伤组织中诱导GUS基因表达。李新玲等[27]从拟南芥基因组中扩增到Rd29A启动子，并将其与GUS基因融合构建成双元植物表达载体，采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草品种龙江851，结果表明，在质量分数15% PEG和质量分数0.5% NaCl胁迫条件下，转基因烟草的GUS表达量明显高于非转基因植株。李双等[28]分别构建了诱导型启动子Rd29A和组成型启动子CaMV35S驱动的异戊烯基转移酶基因(ipt)的植物表达载体，用农杆菌介导法转化到烟草中，结果表明，转Rd29A启动子的植株在4 ℃低温诱导条件下,能够很好的调控ipt基因的表达，与转Rd29A-ipt植株在常温处理以及对照载体在低温和常温处理之间差异显著，而CaMV35S诱导的ipt基因过量表达使植物的生长受到抑制。本研究采用诱导型启动子Rd29A构建载体进行转基因，目的是减少目标基因过量表达对转基因植株生长造成的不良影响。

目前，淡水资源缺乏已成为世界范围内一个不容忽视的问题，而农业用水量高达淡水资源的70%，因此通过遗传改良，提高作物抗旱性，对于缓解我国农业用水困境有着极为重要的意义。ABA作为植物体内的5大生长激素之一，在植物生长发育以及响应水分胁迫、盐胁迫中有重要作用[16]。因此，ABA信号通路一直是植物科学领域的一大研究热点。本研究转化小麦所用外源目标基因PYL5是从拟南芥中克隆的ABA受体蛋白编码基因，其表达的蛋白通过与ABA结合能够抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C)的活性，PP2C在ABA信号传导中起着负调控的作用，它通过抑制SNF1(Sucrose-Nonfermenting Kinase1)相关蛋白激酶2(SnRK2)的活性来抑制ABA信号的转导；PYL5基因在植物体内的表达能够使ABA信号转导途径顺利进行，产生的ABA有促进气孔关闭、水分吸收等生理作用，进而提高植物的抗旱性[18-19]。本研究采用基因枪介导的共转化方法，成功地将由Rd29A驱动的拟南芥PYL5基因转入小麦品种西农889、绵阳19和宁春16中，共获得了7株转基因T0代阳性植株(西农889有2株，绵阳19有1株，宁春16有 4株)。拟南芥的PYL5基因能否在转基因小麦的基因组上整合并稳定遗传，以及目标基因能稳定遗传的转基因后代株系的抗旱性如何，都需要进一步研究。本试验结果为研究转PYL5基因小麦的遗传稳定性及转基因小麦的抗旱性奠定了基础。

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然而，再回头看看潘岳因趋炎附势而横遭政敌灭门的下场，卫玠因身体羸弱而南渡累死途中的结局，慕容冲因轻率冒进薄德寡恩而死于乱军的凄凉，独孤信因权力倾轧不明哲保身而未能善终的遗憾，都似乎让我看到了颜值在对命运的把握和对社会的贡献面前的脆弱和无能为力，更不用说四大美女全部沦为政治牺牲品的可怜结局了。最后人们谈论的历史名人，还是秦皇、汉武、唐宗、宋祖，这些为民族做出重大贡献的人物，还是姜尚、屈原、张良、李靖，这些德才兼备、大智大勇的人物。

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Transformation of wheat withPYL5 gene by biolistic particles and its molecular identification

CHI Qinga,ZHOU Penga,LIU Xiang-lia,b,Cheng Hui-huia,ZHAO Hui-xiana,b

(aCollegeofLifeSciences,bStateKeyLaboratoryofCropStressBiologyforAridAreas,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 The purpose of this study was to obtain transgenic wheat withPYL5 gene based on by biolistic particles.【Method】 Wheat cultivars including Xinong 889,Mianyang 19 and Ningchun 16 were used as acceptors,PYL5 andBargenes were co-transformed into immature callus by biolistic particles.After herbicide selection (Phosphinothricin,PPT) and callus differentiation,the regenerated plants were obtained.Then,allele specific PCR (AS-PCR) was conducted to analyze T0generation of regenerated plants using primers designed according to sequences of target genes.【Result】 1 800 callus of Xinong 889,800 callus of Mianyang 19 and 800 callus of Ningchun 16 were bombarded by biolistic particles,and 9,5 and 14 regenerated plants were obtained,respectively.The regenerated plants were tested using allele specific PCR (AS-PCR) and the obtained transformation frequencies ofBar,PYL5 gene for Xinong 889,Mianyang 19 and Ningchun 16 were 0.280%,0.500%,and 0.750%;0.110%,0.125%,0.500%,respectively,The co-transformation frequencies ofBarandPYL5 were 0.110%,0.125% and 0.500%,respectively.【Conclusion】PYL5 gene was successfully transformed into wheat cultivars Xinong 889,Mianyang 19 and Ningchun 16.

wheat;biolistic particle;co-transformation;PYL5 gene

2013-11-01

转基因生物新品种培育科技重大专项(2011ZX08002-004)；国家自然科学基金项目(31101205)；西北农林科技大学基本科研业务专项 (QN2011111)；国家自然科学基金项目(31471482)

池 青(1988-)，女，河南周口人，在读硕士，主要从事作物遗传改良的分子基础研究。 E-mail：cq1003270059@163.com

赵惠贤(1965-)，女，陕西临潼人，教授，博士生导师，主要从事作物重要性状相关基因及其功能研究。 E-mail：hxzhao212@nwsuaf.edu.cn

时间:2015-01-05 08:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.02.008

S512.1；Q785

A

1671-9387(2015)02-0072-07

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