EdU与BrdU在检测细胞增殖中的特点及应用进展＊

罗 涛 综述，王彤敏，李力燕审校

（昆明医科大学神经科学研究所，昆明650500）

细胞增殖是细胞在周期调控因子的作用下，通过DNA复制、RNA转录和蛋白质合成等一系列复杂反应而进行的分裂过程，是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础［1］。细胞增殖检测广泛应用于分子生物学、免疫学、肿瘤生物学、药理学等研究领域，是评价细胞代谢、生理和病理状况的重要方法［2］。目前，常用的方法包括胸腺嘧啶核苷渗入法、MTT检测法、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法等。但最直接精确的就是利用胸腺嘧啶核苷酸类似物检测新合成的DNA，即5－乙炔基－2′脱氧尿嘧啶核苷（5－ethynyl－2′－deoxyuridine，EdU）和5－溴－2′－脱氧尿嘧啶核苷（5－bromo－2′－deoxyuridine，BrdU）标记［3］。

1 EdU检测增殖细胞的特点及原理

EdU是一种胸腺嘧啶核苷的类似物，其化学结构特点是脱氧胸腺嘧啶环上与5位C原子相连的甲基被乙炔基取代，在S期细胞增殖时可作为底物掺入到正在复制的DNA链中，通过与染料的共轭反应可以进行高效快速的细胞增殖检测［4－5］，其中，乙炔基能够与一种荧光标记的小分子叠氮化合物探针反应，形成稳定的三唑环，该反应是一种被称作“click”化学作用的Cu＋催化的环加成作用［6－7］。EdU 的［3＋2］环加成作用由Cu＋催化完成，由于Cu＋盐的低溶解度，Cu＋通常以配基的形式引入到［3＋2］环加成作用之中［8］。与传统的免疫荧光染色比较，EdU反应非常快速，能在几分钟内完成，且不需要进行DNA变性处理，只需简单的几个步骤，使得组织成像更简单易行［4］，因此也适用于高通量筛选试验，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验［9－10］。

2 EdU标记技术在细胞增殖检测中的应用进展

近年来，EdU标记技术在检测细胞增殖的实验中发挥了重要作用，使用范围越来越广泛。有学者［11］将EdU作为细胞增殖的分子探针，应用于高含量的siRNA（high－content siRNA，HCS）筛选试验，对细胞增殖进行评估。Ohno等［12］首次并成功利用噬菌体荧光标记与EdU来评估噬菌体的宿主范围，并揭示EdU可能会应用于各种类型的噬菌体。Guo等［13］通过腹腔注射EdU，检测GK及Wistar大鼠导管球囊损伤后新生内膜形成的DNA合成情况，验证了EdU掺入和染色是血管内膜检测DNA合成快速、有效的手段。Wiebusch等［14］使用EdU和流式细胞仪研究人巨细胞病毒细胞周期的基因表达。Sun等［15］发现，EdU阳性细胞数与EdU浓度，孵育时间，以及“click”反应溶液的体积相关，最佳的EdU浓度10～50 μmol／L，最佳孵育时间为8～12h。Hoshi等［16］通过把 EdU掺入到DNA中，产生复制带，分析复制带染色体结构，对染色体高级结构的功能意义提出了新的见解。Zhao等［17］发现EdU与DNA的结合会诱导DNA损伤，并通过细胞周期扰乱细胞的进展，随后诱导细胞凋亡，此外，在非小细胞肺腺癌A549细 胞 上 进 行 了 测 试［18－19］。Andersen等［20］的 研 究 发 现 ，EdU在体外和体内都对细胞存活具有很高的冲击，从体内移植到再生肌肉，EDU标记的干细胞难以存活，即使在低EdU浓度下，细胞存活和表型都大幅受损，肌分化潜能也受到抑制。Kohlmeier等［21］使用EdU标记小鼠胚胎干细胞后得出结论，EdU的使用对DNA标记是有限的，因为长时间的培养将发生一定程度的EdU依赖性细胞周期扰动和细胞死亡，不同细胞系中细胞死亡的程度与EdU的掺入量有关，减少标记过程中EdU使用浓度很可能会限制其对细胞增殖的影响。

3 BrdU检测增殖细胞的特点及原理

BrdU是另一种嘧啶类似物，其化学结构特点是溴替代了胸腺嘧啶环与5位C原子连接的甲基，可竞争性掺入到S期新合成的DNA中，利用免疫荧光技术标记增殖细胞［22］，如同时结合其他细胞标记物进行双重染色，可判断细胞种类及增值速度，对研究细胞动力学有重要意义。目前，BrdU标记新合成DNA的方法在动物细胞组织的肿瘤生物学、遗传学、分子生物学等领域得到广泛应用［23］。

4 BrdU标记技术在细胞增殖检测中的应用进展

80年代以来，国外对BrdU标记方法进行了大量研究，其作为DNA前体类似物替代掺入S期细胞，阳性结果表达了S期细胞新合成DNA的水平。研究发现，BrdU用于神经前体细胞的研究，克服了以往实验方法无法对原位标记新生细胞的增殖及分化进行观察的缺点，用于原位标记齿状回神经前体细胞可以准确地反映成年脑组织神经发生水平［24－26］。Tanaka等［27］用BrdU和Ki67抗体通过荧光双标染色和过氧化物酶免疫组化，准确测定增殖细胞中S期分数。Ogawa等［28］则通过对孕鼠进行腹腔注射BrdU，清楚地观察到新生鼠嗅觉系统相关的大脑区域c－Fos蛋白阳性细胞数明显增加。Schmuck等［29］通过用BrdU掺入标记新生成的神经干细胞，快速地追踪到其最终位置，并量化BrdU阳性细胞的密度。Bonvicini等［30］利用BrdU标记准确定位微小病毒B19感染的细胞，并在增殖细胞体外感染的过程中测定DNA含量，发现BrdU剂量不受细胞和病毒复制的干扰，是研究病毒－宿主之间相互作用及不同疾病病因作用的有价值的工具。Vermeulen等［31］用BrdU标记技术检测和鉴定特异性猫T淋巴细胞病毒抗原体外增殖反应。Ivashkina等［32］通过BrdU标记技术发现，在训练的影响下，小鼠大脑中各种结构的BrdU阳性细胞数增加，表明DNA合成增加。Portugal等［33］利用BrdU和绿色荧光蛋白表达，隔离了非洲猪瘟病毒重组体，进一步为野生型病毒基因组的处理提供了有效方法。然而，细胞的生长特性也会受到BrdU的影响，导致细胞出现分化异常、毒性反应、增殖抑制、DNA突变及细胞周期延长等变化［34－35］。值得注意的是，BrdU的标记率不高且对标记细胞具有一定的毒性，毒性作用将随着标记时间的延长而增强，在体外应用时毒性较大，而应用于体内时，毒性明显减轻［34－36］。

5 EdU标记与BrdU标记方法的比较

首先，相比于BrdU检测方法，EdU在DNA合成的过程中引入快速“click”化学反应，并且不需要苛刻的、化学性的或DNA结构酶的破坏［37］。而BrdU抗体分子大，掺入双链DNA内的BrdU，以氢链与腺嘌呤结合，不能直接与BrdU抗体反应，需经解链暴露出DNA双链中的BrdU方能被染色。DNA内部较难变性，如需在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，变性条件下的DNA双链结构受到严重破坏，其他核酸标记探针就不容易识别DNA，因而也无法准确统计新合成DNA总量。DNA变性可能破坏细胞内蛋白的抗原识别位点，限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用［38－39］。其次，EdU只有BrdU抗体大小的1／500，在细胞内更容易扩散，不需要严格的样品变性处理，有效地避免了样品损伤，有助于在组织、器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情况，具有更高的灵敏度和更快的检测速度［40］。但是，与BrdU一样，EdU也有毒性，EdU的掺入会对裂殖的DNA产生损伤，影响细胞的连续繁殖［41］。同样类似的毒害效应也发生在EdU标记动物细胞基因组DNA时，表明EdU只能用于短时期和单细胞周期的实验标记，而BrdU则适用于连续标记多个细胞周期［5］。

6 结 语

EdU与BrdU标记作为两种胸苷类似物掺入到新合成的DNA链中来检测细胞增殖，是一种新型的非放射性同位素细胞增殖检测方法，在细胞培养、实体组织及临床研究均得到了广泛的应用。但两种方法都各有长短，所以，在具体的实验中，应结合实验目的与实验要求，使用多种检测手段，以便更加简单、快速、准确地反映实验结果，双重或多重标记往往会达到事半功倍的效果。在未来的科研进程中，EdU和BrdU标记肯定会继续发挥其突出的作用，当然，新的细胞增殖检测手段也必然会随之产生。

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