毛壳菌几丁质酶的酶学性质及抑菌活性研究

孙 辉,杨金奎,张克勤

(1 仲恺农业工程学院 农学院，广东 广州 510225；2 云南大学 云南省生物资源保护与利用重点实验室, 云南 昆明650091)

毛壳菌几丁质酶的酶学性质及抑菌活性研究

孙 辉1,杨金奎2,张克勤2

(1 仲恺农业工程学院 农学院，广东 广州 510225；2 云南大学 云南省生物资源保护与利用重点实验室, 云南 昆明650091)

【目的】 研究毛壳菌(Chaetomiumsp.YMF1.00843)产胞外几丁质酶的酶学性质及抑菌活性，为几丁质酶的抑菌作用机理研究提供依据。【方法】 利用蛋白活性电泳方法纯化几丁质酶液，测定几丁质酶的酶学性质，并用酶液浸泡病原菌菌块，研究酶液的抑菌活性。【结果】 用蛋白活性电泳方法得到几丁质酶的纯酶液，经检测为电泳纯条带，分子质量为43 ku。毛壳菌几丁质酶的最适反应温度为40 ℃，最适pH为6，40 ℃以下保温30 min均能保持其初始活性，在pH 5～9保温30 min仍旧具有较高的活性，Ca2+和Zn2+能明显增强几丁质酶的活性，其纯酶液能抑制立枯丝核菌和烟草赤星病菌的菌丝生长。【结论】 毛壳菌几丁质酶在比较温和的条件下能保持一定的活性，纯酶液对部分病原真菌有较强的抑制作用。

毛壳菌；几丁质酶；酶学性质；抑菌活性

随着人们对环境和健康问题的日益关注，农业生产中植物病害的防治方法正加紧由传统的化学防治向生物防治发展转变。生防真菌和植物病原真菌之间的互作一直是大量研究者最为关注的问题。由于菌丝在植物根围具有更大的生长潜力以及可与寄主建立起多样的作用方式，真菌作为生防菌较细菌具有更广泛的扩展空间[1]。近年来，已有大量的真菌种类和分离物被作为生防因子用于生物防治，如木霉、粉红粘帚霉、淡紫拟青霉等[2-4]。

毛壳菌作为一种新兴的生防因子，也受到了越来越广泛的关注。毛壳菌的生防机理主要包括重寄生作用、产生抗生物质、酶降解作用等，其中酶对病原真菌细胞壁的主要结构成分发挥降解作用，尤其是真菌细胞壁的特征性成分几丁质[5]。在Soytong等[6]描述的球毛壳菌生物防治机制的相关因素中，几丁质酶作为单独的一类重要因素在生防中发挥着重要作用。

本研究前期工作中分离得到1株具有较强抑菌活性的毛壳菌属真菌。因此，为完善毛壳菌生物防治机制的相关背景，本研究对毛壳菌(Chaetomiumsp.YMF1.00843)胞外几丁质酶进行分离纯化，并测定了其酶学性质，同时对纯酶的抑菌活性进行了初步测定，以期为几丁质酶的抑菌作用机理研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株来源 毛壳菌(Chaetomiumsp.YMF1.00843)，分离自土壤，初筛获得产酶较高的菌株；立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、烟草赤星病菌(Alternariaalternate)，由云南大学微生物发酵重点实验室提供。

1.1.2 培养基 1)PDA培养基。去皮马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，用于真菌的接种、保藏。2)WA培养基。1 L水加入20 g琼脂，用于抑菌活性培养观察。3)OL培养基。燕麦片1 g/L，几丁质粉0.5 g/L，明胶0.5 g/L，酵母粉1 g/L，蛋白胨1 g/L，(NH4)2SO41 g/L，无机盐溶液50 mL(无机盐成分：K2HPO420 g/L，MgSO4·7H2O 5 g/L，NaCl 2 g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，MnSO40.1 g/L，ZnSO40.1 g/L)，加水补充体积至1 L，调节pH至7.0，分装于250 mL三角瓶，每瓶100 mL。分别于121 ℃高温高压湿热灭菌20 min，用于供试菌株的培养及胞外酶的获取。

1.2 方 法

1.2.1 几丁质酶的酶活曲线 将培养4 d的毛壳菌接种到OL培养基中，28 ℃、200 r/min摇床培养，每隔1 d取样，连续取12 d。

1.2.2 几丁质酶粗酶液的提取和纯化 1) 粗酶液的提取。在摇瓶发酵培养到产酶量高峰期时，滤去菌丝，收集发酵液。用(NH4)2SO4沉淀蛋白，将蛋白离心后的沉淀以最小体积溶解于pH为6的磷酸缓冲液中，4 ℃下用相同的缓冲液透析。待粗酶液透析充分后与透析袋一起埋入PEG6000中，于4 ℃条件下进一步浓缩，得到体积大小为2 mL的粗酶液，备用。

2) 几丁质酶的纯化。几丁质酶的纯化参考王东辉等[7]的方法，并稍加改进。活性电泳完毕后，将分离胶从上至下依次切割成宽约2 mm的凝胶条，取每条凝胶的1/5研碎后加入底物检测几丁质酶的活性，剩余部分用10 mmol/L的磷酸缓冲液(pH6.0)将蛋白浸泡析出。

1.2.3 几丁质酶酶学性质的测定 1)最适反应温度。在1.5 mL的Eppendorf管中加入100 μL纯化的酶液，再加入200 μL胶体几丁质(1%)溶液，混合均匀，分别在20，30，40，50，60，70，80 ℃条件下保温30 min，加入DNS试剂，沸水中煮沸10 min。以磷酸缓冲液加底物为对照，比色法测定不同温度条件下几丁质酶的活性。

2)温度稳定性。在1.5 mL的Eppendorf管中加入100 μL纯化的酶液，在20，30，40，50，60，70，80 ℃下保温30 min，然后在每个Eppendorf管中加入200 μL胶体几丁质(1%)溶液，混合均匀，在最适反应温度下保温30 min，加入DNS试剂，沸水中煮沸10 min，比色法测定几丁质酶的活性。

3)最适反应pH。在1.5 mL的Eppendorf管中加入100 μL纯化的酶液，再加入200 μL用pH分别为3，4，5，6，7，8，9的缓冲液配制的胶体几丁质(1%)溶液，混合均匀，在最适温度下保温30 min，加入DNS试剂，沸水中煮沸10 min，比色法测定几丁质酶的活性。

4) pH稳定性。在1.5 mL的Eppendorf管中加入100 μL纯化的酶液和400 μL pH分别为3，4，5，6，7，8，9的缓冲液，混合均匀，放置30 min。再加入200 μL胶体几丁质(1%)溶液，在最适温度下保温30 min，加入DNS试剂，沸水中煮沸10 min，比色法测定几丁质酶的活性。

5)金属离子对酶活性的影响。先将含Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+和Mn2+的盐用缓冲液配成溶液，各自所含的金属离子浓度均为5 mmol/L。将底物胶体几丁质和纯化的酶液加入到金属离子溶液中，使其充分混匀，在最适温度下保温30 min，比色法测定几丁质酶的活性，以未加金属离子的缓冲液为空白对照。

1.2.4 几丁质酶抑菌活性的测定 将培养在PDA培养基上的立枯丝核菌和烟草赤星病菌，切成长度为2 mm大小的菌块，投入到纯化的几丁质酶液中，在28 ℃下浸泡8 h，取出后再接种到WA培养基上培养24 h，显微镜下观察目标菌的生长情况。

2 结果与分析

2.1 几丁质酶的酶活曲线

用摇瓶发酵测定毛壳菌产几丁质酶的酶活曲线，结果见图1。图1表明，接种到产酶培养基中的毛壳菌菌株生长迅速，培养第2天就开始形成大小均一的菌球，并开始分泌几丁质酶，在培养的第5天几丁质酶活力达到最高，之后几丁质酶活力平缓下降，到摇瓶培养12 d后仍可以检测到酶活性的存在。

2.2 几丁质酶的分离纯化

经活性电泳方法纯化得到具有几丁质酶活性的条带，回收活性样品成分，用SDS-PAGE电泳检测，得到1条电泳纯条带，分子质量约为43 ku(图2)。收集的几丁质酶活性成分中无其他成分干扰，说明几丁质酶基本达到电泳纯，而且回收率较高。

2.3 几丁质酶的酶学性质

2.3.1 最适反应温度 由图3可以看出，毛壳菌产几丁质酶的最适反应温度为40 ℃，低于或高于这个温度几丁质酶反应活性明显降低，60 ℃时几丁质酶活性是40 ℃时的50%，到80 ℃时则完全检测不到酶活性。说明该酶适合在比较温和的温度下发生反应。

2.3.2 温度稳定性 由图4可以看出，毛壳菌产几丁质酶在40 ℃以下保温30 min均能保持其原来的活性，高于40 ℃以上保温，其活性丧失速度较快，在70 ℃以上保温30 min就完全丧失活性，说明该酶在较低的温度(40 ℃以下)条件下可以保持稳定性。

2.3.3 最适反应pH 由图5可以看出，毛壳菌产几丁质酶的最适pH为6，在pH 4～8都有相对较高的活性，具有70%以上的相对活力。说明该几丁质酶在中性偏酸性的条件下具有较高的酶活性。

2.3.4 pH稳定性 由图6可以看出，毛壳菌产几丁质酶在pH 5～9的条件下保温30 min仍旧具有较高的活性，相对酶活性可以达到80%以上。

2.3.5 金属离子对几丁质酶活力的影响 由图7可以看出，Ca2+和Zn2+能明显增强几丁质酶的活性，Cu2+和Fe2+则对几丁质酶的活性有强烈抑制作用，其中Cu2+能抑制50%的酶活性，而Fe3+和Mn2+对几丁质酶的活性影响不大。

2.4 几丁质酶的抑菌活性

2.4.1 对立枯丝核菌的抑制作用 用纯化的几丁质酶浸泡立枯丝核菌菌块8 h，再接种到WA培养基上，24 h后显微镜下观察发现，菌块边缘无新的菌丝长出(图8-A)，而在灭活的几丁质酶液处理的菌块边缘则有菌丝生长，且延伸较长，生长旺盛(图8-B)，说明几丁质酶可以有效抑制立枯丝核菌菌丝的生长。

2.4.2 对烟草赤星病菌的抑制作用 由图9可以看出，灭活酶液处理菌块菌丝生长旺盛(图9-A)，而几丁质纯酶液处理烟草赤星病菌菌块边缘同样无菌丝长出(图9-B)，说明几丁质纯酶液同样完全抑制了烟草赤星病菌菌丝的生长。

3 讨 论

生防真菌在侵染穿透寄主真菌细胞壁时能产生细胞壁降解酶(几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶等) ，在侵染过程中起着直接作用，其中以几丁质酶和葡聚糖酶的作用更为重要[8-11]。Elad等[12]发现,在哈茨木霉寄生齐整小核菌(SclerotiumrolfsiiSacc.)菌核的过程中，可在菌核内部检测到木霉分泌的几丁质酶及β-1，3-葡聚糖酶活性。林丽等[13]利用2种酵母菌防治桃采后的真菌病害，发现这2种酵母菌产生的几丁质酶对软腐病菌孢子的萌发有明显的抑制作用。几丁质酶是生防真菌防治植物真菌性病原菌的主要机制之一，其能降解真菌的细胞壁，从而达到防治病害的目的[14]。

几丁质酶的纯化方法很多，其中较为常用的有阴离子交换层析法、凝胶过滤层析法、免疫亲和层析法等。也有研究者采用酶与底物结合然后洗涤的方法得到纯酶[15]。本研究用改良过的活性电泳方法对几丁质酶进行纯化，该方法在实验室操作简便，所需器材简单，同时也能得到较好的纯化效果。微生物几丁质酶的分子质量差异很大, 一般为10～100 ku[16-17]。而真菌来源的几丁质酶的分子质量大小比较接近，大部分在40～50 ku[16]。本试验纯化得到的几丁质酶的分子质量在43 ku左右，与其他真菌来源的大部分几丁质酶的分子质量比较接近。

Toyoda等[18]从灰霉素链霉菌(Streptomycesgriseus)菌株分离纯化得到几丁质酶，可以消解正在发育的白粉病菌的吸器，并抑制白粉菌丝的伸长。本研究结果表明,纯化几丁质酶能明显抑制立枯丝核菌和烟草赤星病菌菌丝的伸长，使几丁质酶的抑菌作用得到较充分的证实。但有关几丁质酶与其他细胞壁降解酶(β-1，3-葡聚糖酶、蛋白酶等)的协同作用关系，以及其与病原菌的具体作用机制还有待于进一步研究。

[1] Elad Y.Biological control of foliar pathogens by means ofTrichodermaharzianumand potential modes of action [J].Crop Protection,2000,19:709-714.

[2] 马桂珍，王淑芳，暴增海，等．粉红粘帚霉67-1菌株对水稻纹枯病的抑菌防病作用研究 [J].作物杂志，2011(6)：77-80．

Ma G Z，Wang S F，Bao Z H，et al．Inhibition and protective activities ofGliocladiumroseum67-1 toRhizoctoniasolanii[J].Crops, 2011(6)：77-80．(in Chinese)

[3] 李 芳，史 怀，刘 波，等．淡紫拟青霉对尖孢镰刀菌的拮抗作用与机制分析 [J].植物保护学报，2005，32(4)：373-378．

Li F,Shi H,Liu B,et al.Antagonistic effect of biocontrol fungus,Paecilomyceslilacinusstrain NH-PL-03 and its mechanism againstFusariumoxysporum[J].Acta Phytophylacica Sinica,2005,32(4)：373-378.(in Chinese)

[4] Pozo M J,Baek J M,Garcia J M,et al.Functional analysis oftvsp1,a serine protease-encoding gene in the biocontrol agentTrichodermavirens[J].Fungal Genetics and Biology,2004,41:336-348.

[5] Rast D M,Baumgartner D,Mayer C,et al.Cell wall-associated enzymes in fungi [J].Phytochemistry,2003,64:339-366.

[6] Soytong K,Kanokmedhakul S,Kukongviriyapa V,et al.Application ofChaetomiumspecies (Ketomium®) as a new broad spectrum biological fungicide for plant disease control:A review article [J].Fungal Diversity,2001,7:1-15.

[7] 王东辉，韩 韬，龚化勤，等．一种利用普通垂直电泳槽回收PAGE胶蛋白条带的简便方法 [J].植物生理学通讯，2004，40(1):75-77．

Wang D H,Han T,Gong H Q,et al.A simple method for protein recovery with ordinary electrophoresis apparatus [J].Plant Physiology Communications,2004,40(1)：75-77.(in Chinese)

[8] Arlorio M,Ludwig A,Boller T,et al.Inhibition of fungal grow-th by plant chitinases and β-1,3-glucanases:A morphological study [J].Protoplasma,1992,171:431-434.

[9] Taylor G,Jabaji-Hare S,Charest P M,et al.Purification and characterization of an extracellular exochitinase,B-N-acetylhexosaminidase,from the fungal mycoparasiteStachybotryselegans[J].Canadian Journal of Microbiology,2002,48(4):311- 319.

[10] Cohen-Kupiec R,Broglie K E,Friesem D,et al.Molecular characterization of a novel β-1,3-exoglucanase related to mycoparasitism ofTrichodermaharzianum[J].Gene，1999,226:147-154.

[11] Sanz L,Montero M,Redondo J,et al.Expression of an a-1,3-glucanase during mycoparasitic interaction ofTrichodermaasperellum[J].FEBS Journal,2005,272:493-499.

[12] Elad Y,Chet I,Boyle P,et al.Parasitism ofTrichodermaspp.onRhizoctoniasolaniandSclerotiumrolfsii-scanning electron microscopy and fluorescence microscopy [J].Phytopathology,1983,73：85-88.

[13] 林 丽，田世平，秦国政，等．两种拮抗酵母对桃果实贮藏期间的主要病害防治效果 [J].中国农业科学，2003，36(12)：1535-1539．

Lin L,Tian S P，Qin G Z,et al.Biocontrol of postharvest diseases in peach fruits using two antagonistic yeasts during storage periods [J].Scientia Agricultura Sinica,2003,36(12):1535-1539.(in Chinese)

[14] 马汇泉， 甄惠丽， 孙伟萍．几丁质酶及其在抗植物真菌病害中的作用 [J].微生物学杂志，2004，24(3)：50-53．

Ma H Q,Zhen H L,Sun W P.Chitinase and its effects on plant fungal disease prevention [J].Journal of Microbiology,2004,24(3):50-53.(in Chinese)

[15] 张新军，岳海梅，张伏军，等．一种简便易行的几丁质酶纯化法 [J].食品与发酵工业，2011，37(5)：83-87．

Zhang X J，Yue H M，Zhang F J,et al.A simple and convenient method in the process of chitinase purification [J].Food and Fermentation Industries,2011,37(5)：83-87.(in Chinese)

[16] Gleave A P,Taylor R K,Morris B A,et al.Cloning and sequencing of a gene encoding the 69-kDa extracellular chitinase ofJanthinobacteriumlividum[J].FEMS Microbiology Letters,1995,131:279-288.

[17] Tanabe T,Kawase T,Watanabe T,et al.Purification and cha-racterization of a 49-kDa chitinase fromStreptomycesgriseusHUT 6037 [J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2000,89:27-32.

[18] Toyoda H，Matsuda Y，Yamaga T，et al.Suppression of the powdery mildew pathogen by chitinase microinjected into barley coleoptile epidermal cells [J].Plant Cell Reports,1991,10(5)：217-220.

Enzymatic properties and antibacterial activity of chitinase fromChaetomiumsp.YMF1.00843

SUN Hui1，YANG Jin-kui2，ZHANG Ke-qin2

(1CollegeofAgronomy,ZhongkaiUniversityofAgricultureandEngineering,Guangzhou,Guangdong510225,China;2LaboratoryforConservationandUtilizationofBio-Resources,YunnanUniversity,Kunming,Yunnan650091,China)

【Objective】 This research was conducted to study the enzymatic properties and antibacterial activity of chitinase fromChaetomiumsp.YMF1.00843,and lay foundation for further study of its inhibition mechanism.【Method】 Chitinase was purified by a one-step,native gel purification procedure before the properties were tested.Then,the antibacterial activity was confirmed by dipping pathogen bulk in enzyme solution.【Result】 Molecular weight of purified chitinase was 43 ku.Optimal temperature of chitinase was 40 ℃ and optimal pH was 6.0.Chitinase can maintain the initial activity at 40 ℃ or at pH of 5-9 for 30 min.The activity of chitinase was improved by Ca2+and Zn2+.The hyphae ofRhizoctoniasolaniandAlternariaalternatecan be effectively inhibited by purified chitinase. 【Conclusion】 Chitinase can maintain its activity at mild conditions and it can strongly inhibit the growth of several pathogens.

Chaetomiumsp.;chitinase;properties of enzyme;antibacterial activity

2013-11-11

国家自然科学基金项目(301600004)；云南省重点实验室开放基金项目(KF-9803)

孙 辉(1978-)，女，黑龙江宝清人，讲师，主要从事植物病害防治研究。E-mail：lemonsunh@163.com

时间:2015-04-13 12:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.05.009

S476.12

A

1671-9387(2015)05-0168-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150413.1259.009.html