心肌再生的现状及展望

顾蓉 综述 王涟 徐标 审校

(南京大学医学院附属南京鼓楼医院心内科，江苏南京 210008)

心肌再生的现状及展望

顾蓉 综述 王涟 徐标 审校

(南京大学医学院附属南京鼓楼医院心内科，江苏南京 210008)

人类左心室包含了20亿～40亿个心肌细胞，而一次心肌梗死在几小时内就可以丢失掉5亿～10亿的心肌细胞［1］。随着人体的衰老，大约每年会丢失1g的心肌组织(约2 000万个心肌细胞)。各种心脏疾病发展的终末阶段——心力衰竭也是以心肌细胞的丢失、残留心肌细胞的功能恶化为主要特征。而心脏移植因其供体来源有限也只能使极少数患者获益。因此促进心肌细胞的再生，恢复有功能的心肌细胞数量，从根本上修复损伤的心肌组织就成为亟待发展的治疗策略。总结心肌细胞再生的证据，目前心脏干细胞移植在心肌再生中的地位及存在问题、最近研究发现的微小核糖核酸(microRNA)以及胞外基质对于心肌再生的影响，并对心肌再生的未来进行展望。

1 心肌细胞再生的证据

既往的研究显示许多两栖类和鱼类在损伤后可以再生肢体以及一些内脏器官。通过手术将斑马鱼的心室切除20%，在两月内切除的心肌能完全再生。在生理状态下，斑马鱼的心肌细胞比等量的哺乳动物心肌细胞具有更高的细胞循环活性［2-4］。

最近的研究发现人类以及其他哺乳动物的心脏在正常衰老及疾病过程中同样具有一定程度的再生能力［5］。如Porrello等［6］报道了将出生一天的小鼠左室心尖部切除(约为左室心肌质量的15%)，小鼠不但存活而且切除的心肌在三周左右可以再生，八周时心脏收缩功能即完全恢复。

两个研究直接地证实人类心肌细胞的更新潜能。Frisen等利用冷战时期核爆炸产生的大气中的14C整合到植物中被人类通过食物链摄取，而14C结合分裂细胞DNA的原理证实了成人心肌具有自我更新潜能［7］。另一项由Kajstura等［8］对用胸腺嘧啶脱氧核苷类似物(IdU)治疗的肿瘤患者进行心脏解剖来研究DNA合成速率。研究者发现这类患者的心肌细胞DNA合成显著增多。这些研究都提供了强大的证据证实人类成体心脏存在核分裂和可能的心肌细胞数目增殖，但是这是一个非常有限而缓慢的过程，并不足以在心肌梗死或心脏受到其它损伤时修复心脏使心脏功能恢复正常。所以，我们需要进一步地研究来调控这一过程，以期获得最大的治疗作用。

2 干细胞和细胞治疗

2.1 心肌再生的干细胞来源

干细胞治疗的研究早在2000年初就已广泛开展以期治疗心脏病，从动物实验中得到的证据表明损伤的心脏功能可以通过扩增具有自我增殖和分化潜能的干细胞诱导组织再生得以恢复。

目前常用的干细胞类型包括胚胎干细胞(ESC)、骨髓源性干细胞(BMSC)、间充质干细胞(MSC)等。

ESC来源于胚囊的内细胞团，其移植治疗心肌梗死可以再生缺血区域的心肌、改善左室功能。但是真正分化为心肌细胞并具有良好的收缩能力的细胞数量有限，并存在伦理方面的问题［9-11］。ESC还可能会引起畸胎瘤和免疫排斥反应。鉴于以上原因，目前还没有开展用ESC治疗心脏患者的临床研究。

多项研究证实BMSC移植可以有效地改善心脏功能［12-14］。33项临床试验(入选1 765例急性心肌梗死患者)的统计分析证实BMSC的移植可以改善左室射血分数。Jeevanantham等研究发现，骨髓细胞移植能改善慢性缺血性心肌病(IHD)患者左室功能、减少梗死面积和改善心肌重构，在长期随访中证实该获益持续存在［15］。Ronak Delewi等meta分析发现，冠状动脉内注射骨髓细胞可改善ST段抬高型心肌梗死患者的心功能。

MSC因其来源广泛(包括骨髓、脂肪组织和脐血等)而颇具优势。由于MSC分化为心肌细胞的速率非常低，故体内治疗作用的主要机制被认为是其通过旁分泌作用分泌各种促进梗死区细胞存活、生长和分化的细胞因子;另外，MSC具有免疫耐受性，因为上述特点，MSC在异体移植方面具有重要地位。APOLLO试验是在14例急性ST段抬高型心肌梗死患者中，研究冠脉内注射脂肪源性MSC(2 000万个细胞)的安全性和可行性的研究。SPECT分析证实与安慰剂组比较对于左室射血分数有改善的趋势(未达统计学差异)。更大规模的临床研究正在计划开展。

成肌细胞存在于肌肉的基底膜，可以再生肌肉组织。它们可以有效地对抗缺血，在体内可以分化成肌管。所以，成肌细胞被认为可以作为细胞疗法促进心肌再生。一些使用成肌细胞的研究也已证实可以改善左室功能［16］。尽管有一些有益的结果，但移植的成肌细胞并不能有效地分化为心肌细胞。另外，MAGIC实验报道移植到缺血性心脏病患者体内的成肌细胞会引起严重的毒副作用，如各种心律失常［17］。

2007年，Yamanaka等用逆转录的方式从体细胞诱导产生了多能干细胞(iPSC)。因为没有伦理学的问题，迅速成为干细胞治疗新的细胞来源。iPSC可分化成包括心肌细胞在内的各种细胞系。虽然iPSC已经显示了有益的促进心脏再生的结果，但其扩增效率及向心肌细胞的分化效率都很低，分化产生了包括非心肌细胞在内的各种类型细胞［18］。另外，iPSC与ESC同样存在致畸胎瘤及移植后的免疫排斥反应等问题。iPSC目前还处于临床前研究阶段，其诱导方法也在进一步研究中。

有趣的是，最近的研究证实可以通过三种心脏转录因子(Gata4、Mef2c和Tbx5)从心脏和皮肤成纤维细胞直接编程产生心肌细胞样的细胞［19］。已有研究显示这些细胞移植可以减少小鼠的心肌梗死面积，改善心脏功能［20］。但关于其临床应用的安全性仍存在争议。

心脏本身也包含了不同的具有前体细胞特性的未分化细胞。最近一项用自体c-Kit+的心脏原位祖细胞移植治疗缺血性心脏病的临床研究已经取得了令人鼓舞的结果［21］。同时，激活原位心脏祖细胞分化潜能的策略也具有独到的优势，因其可以避免使用外源性干细胞所需要的繁琐的分离、纯化、扩增及再转染过程。

2.2 干细胞移植修复心肌存在的问题

虽然关于干细胞的研究在如火如荼地开展，但不可否认，干细胞疗法治疗心血管疾病尚存在一定问题。(1)移植后干细胞生存时间有限，故对干细胞进行修饰、改善移植微环境以使其更好地存活和发挥治疗作用可能是一种有前途的治疗策略。研究小组转染整合素连接激酶(ILK)修饰的MSC治疗心肌梗死观察到其可以显著提高干细胞的归巢率、增强其生存能力、促进旁分泌作用，从而发挥更大的治疗作用［22］。2014年的ACC年会上，杨跃进教授等报告采用阿托伐他汀预处理，可通过上调CXC趋化因子受体4(CXCR4)的表达促进MSC向梗死心肌归巢并改善心肌梗死大鼠的心功能，并可通过抑制RhoA/ROCK/ERK通路改善心肌梗死后的微环境，促进移植MSC的存活。另有研究采用生长因子或细胞因子来促进骨髓中祖细胞的动员，但遗憾的是在不同的随机、对照临床试验中都未能重复出临床前研究的有效性。(2)移植的干细胞只有很小一部分可以真正分化为有功能的心肌细胞，故需要移植大量的干细胞［23］，国内葛均波领导的课题组采用了多次移植的方法取得了一定的疗效。(3)干细胞的移植途径问题，目前常用的干细胞疗法采用冠脉内注射，但这些方法的细胞归巢率较低，而心肌内直接注射可能会诱发室性心律失常，其安全性没有得到证实［24］。(4)另外，不同的研究采用的干细胞剂量也是相差迥异，合适的移植剂量尚未达成共识。(5)干细胞的移植时机问题。心肌梗死作为一个缺血事件，随后会发生显著的炎症反应，巨噬细胞和其它免疫细胞会分泌一些细胞因子和生长因子，将细胞移植到这种环境中会导致大量的细胞死亡。我们推测移植的干细胞甚至也参与了炎症的瀑布反应。既往研究显示移植的最优时间似乎是在心肌梗死后最初一个月内。

基于先前的研究结果，不同的干细胞可以在心脏再生方面发挥有益的作用。然而，要使这些细胞真正用于临床治疗还有许多壁垒要攻克。不管怎样，发挥干细胞的所有优点，创造一种综合性治疗策略，可能会在心肌修复领域发挥更有效的作用。

3 微小核糖核酸诱导心脏再生

除了上述的干细胞疗法，最近的研究兴趣集中于基因及小分子为基础的治疗策略来增加内源性的心肌细胞增殖潜能。研究显示，心肌细胞的microRNA通路受损会导致心力衰竭和心肌病［25-26］。另外，许多microRNA表达谱的改变与不同的心脏病理过程相关。2012年12月《Nature》杂志报道通过给予选择性的microRNA可以显著促进心肌细胞增殖和心脏修复。40种microRNA可以有效增加乳鼠心肌细胞的DNA合成和胞质分裂。进一步研究证实microR-590和microR-199a可以促进成体心肌细胞再次进入细胞循环，促进乳鼠和成体鼠的心肌细胞增殖［27］。在小鼠心肌梗死后，这些microRNA可以显著促进心脏再生，并几乎使心脏功能完全恢复。

4 胞外基质对于心脏再生的影响

心脏胞外基质的基本成分是Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原。研究发现细胞能感觉到外周环境，胞外基质对于心脏再生也具有重要影响。Ⅰ型胶原主要在健康心脏中表达，而Ⅲ型胶原在心脏受到损害时表达增多。在进展到心力衰竭过程中胞外基质广泛沉积，导致了心脏纤维化。除了影响心肌纤维的排列，胞外基质也可以影响新生心肌细胞核的排列。另外，胞外基质对于干细胞也会产生影响。Flk-1+心脏干细胞在层黏连蛋白包裹的三维支架上比在Ⅳ型胶原包裹的支架上能够更好地增殖。MSC在包裹有不同胶原亚型的胞外基质上培养显示，Ⅴ型胶原促进心肌分化而Ⅰ型和Ⅲ型胶原则没有该作用。

胞外基质的顺应性在发育和疾病过程中发生了改变，基质的软硬程度在一定程度上决定了干细胞的分化方向，另外，MSC的迁移也受基质强度的影响。当然，组织强度不是唯一影响分化的因素。当分离的心脏单核细胞在具有不同孔径大小的三维基质中培养，心肌分化潜能也受影响［28］。

值得提出的是，祖细胞-基质的影响并不是单向的。心脏祖细胞自身也可以合成胞外基质，所以，在病理性心脏中，祖细胞可直接或通过旁分泌作用影响胞外基质的属性。

因此，应用组织工程的方法优化细胞生长的微环境对于改善细胞的活力，促进心肌再生可能会产生意想不到的效果。目前组织工程技术的应用已在大鼠模型中观察到可以改善心脏功能，但这种方法是否可用于大的动物甚至人类还有待研究。

5 展望

综上所述，目前促进心肌再生的研究策略可大体归纳为通过动员心脏干细胞或祖细胞，通过基因干预凋亡、自噬和坏死的信号通路，增加细胞的存活通路，促进已存在的心肌细胞再次进入细胞循环及改善细胞微环境来实现。经过十余年的研究，干细胞治疗、基因调控燃起了人们对于心肌再生的希望。关于合适的细胞类型，移植后细胞活力的保持，建立实用、安全的细胞转染技术，基因调控的位点、强度及时机等都在进一步研究中。

总之，心脏再生医学领域方面仍有许多问题亟待解决，但我们相信，通过研究者在已有的研究成果基础上坚持不懈的努力，在心肌再生和修复方面必将迎来一个又一个令人振奋的结果，让我们拭目以待。

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Perspectives and Prospects on Cardiac Regeneration

GU Rong，WANG Lian，XU Biao
(Department of Cardiology，Nanjing Drum Tower Hospital，Nanjing University Medical School，Nanjing 210093，Jiangsu，China)

促进心肌再生、修复心肌组织为亟待发展的治疗策略。目前促进心肌再生的方法可大体归纳为通过动员心脏干细胞或祖细胞，通过基因干预凋亡、自噬和坏死的信号通路，增加细胞的存活通路，促进已存在的心肌细胞再次进入细胞循环及改善细胞微环境来实现。同时，心脏再生医学领域仍有许多问题亟待解决，随着研究的深入，在心肌再生领域必将迎来令人振奋的结果。

心肌再生;干细胞;微小核糖核酸;胞外基质

The promotion of therapeutic strategies focused on cardiac regeneration and the repair of damaged myocardial tissue should be developed quickly.Atpresent，the strategies to promote cardiac regeneration includemobilizing stem cells or progenitor cells，intervening signal pathway of apoptosis，autophagy and necrosis by genes，up-regulating signal pathway of survival，and promoting pre-existingmyocardiocytes to re-enter the cell cycle，among others.There are alsomany problems facing the field of cardiac regeneration.However，the development of combined treatments for both cardiac regeneration and the repair of damagedmyocardial tissuewould lead to the next-generation ofcardiology.

cardiac regeneration;stem cells;microRNA;extracellularmatrix

1004-3934(2015)01-0070-04

R364.3+3

A

10.3969/j.issn.1004-3934.2015.01.020

2014-06-04

2014-09-05

国家自然科学基金(81200092);南京市医学科技发展资金资助(QRX11158)

顾蓉(1984—)，主治医师，博士，主要从事心肌梗死后心力衰竭的发病机制及治疗研究。Email:gurong.nju@163.com