蔗糖浓度和外源2,4-D与KT浓度对三七幼叶细胞悬浮培养影响的研究

李 涛，李小清，张智慧，李 燕，郭秋月，田 立，刘俊林

(西北民族大学生命科学与工程学院, 甘肃兰州730030)

蔗糖浓度和外源2,4-D与KT浓度对三七幼叶细胞悬浮培养影响的研究

李 涛，李小清，张智慧，李 燕，郭秋月，田 立，刘俊林*

(西北民族大学生命科学与工程学院, 甘肃兰州730030)

将云南文山三七幼叶诱导出愈伤组织，并采用悬浮震荡培养三七细胞.细胞培养基质中的碳源浓度和激素浓度对培养细胞生长的影响进行研究，实验结果显示：MS+1.5 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L KT+28 g/L蔗糖，pH 为5.8的培养基最适合文山三七幼叶诱导得到的愈伤组织细胞悬浮的培养.

文山三七；细胞培养；蔗糖浓度；激素浓度

三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F. H. Chen)又名田三七、参三七、血参等，是我国传统的珍贵中药材.云南省文山州是三七的主要产地.现代科学研究发现，三七主要成分为三七总皂甙、三七素、三七黄酮、三七多糖、挥发性油、氨基酸等，都具有改善心脑血管疾病、降血糖、降血脂、降血压、抗血栓、抗衰老、抗炎、镇痛、镇静、增强免疫力等作用[1,2].文山三七药效多样，药食同源，在中药里占有重要地位.以三七为原料的药品、保健食品、化妆品等产品繁多，三七原材料及其产品的市场国内外正逐步扩大.目前,三七产品均以人工种植的三七植株为原材料，这种产品不仅成本高、效率低，而且人工种植受到气候、地域、病虫害和种植技术等因素的影响，致使三七原材料价格昂贵.

采用植物细胞培养技术研究和开发三七，可以保护三七优质种质资源和进行三七生理、药理、遗传和育种研究.对三七有关的产业来说，植物细胞培养技术可以人工控制培养条件，缩短培养时间，可以直接从培养产物中提取三七的代谢物.只要培养技术成熟、培养条件适宜，理论上是可以提高生产效率和降低生产成本的.目前有关三七细胞培养的报道不多，主要是关于培养基质的研究，而且研究成果多种多样.在王艳[3]等人的研究中，三七悬浮培养基质为MS 培养基 + 2 mg/L 2,4-D + 1 mg/L KT + 30 g/L蔗糖，pH 为5.8.细胞培养基质中蔗糖是最重要的碳源，而且是重要的渗透压调节剂[4].外源激素起到诱导和促进增殖、影响细胞形态的重要作用，常用激素为2,4-D和KT.

本实验经细胞培养基质中的蔗糖浓度和激素(2,4-D和KT)浓度对培养细胞的生长影响进行研究，为更好地进行三七细胞培养提供一定的理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料三七采自云南文山州三七种植户种植基地，在西北民族大学生命科学与工程学院生化实验室对其幼叶进行诱导，得到的愈伤组织用于细胞培养.

1.2 方法

本试验在王艳等人研究成果的基础上设置培养基质中的蔗糖浓度梯度和激素浓度梯度，将愈伤组织加入到实验培养液中(接种量为干重2 g/L),于摇床上进行悬浮培养, 转速120 rpm, 温度26±l ℃下暗培养30 d[5].细胞培养液在 4 000 r/min 下离心10 min，收集沉淀，于50 ℃恒温箱中干燥至恒重，精确称重，由细胞干重净增量[细胞干重净增量(g/L)= 收获量(g/L)-接种量(g/L)]进行评价.

1.3 蔗糖浓度对三七幼叶细胞悬浮培养影响试验

培养基为：MS 培养基+2 mg/L 2,4-D +1 mg/L KT + 不同浓度蔗糖，pH为5.8.蔗糖浓度梯度设置如表1.

1.4 激素浓度对三七幼叶细胞悬浮培养影响试验

培养基设置两个平行对照组(a,b).a组为：MS 培养基+不同浓度2,4-D +不同浓度KT+28 g/L蔗糖，pH为5.8.

b组为：MS培养基+不同浓度2,4-D+不同浓度KT+30 g/L蔗糖，pH为5.8.两组激素浓度梯度设置如表2所示.

表1 蔗糖浓度对三七幼叶细胞悬浮培养影响试验 表2 激素浓度对三七幼叶细胞悬浮培养影响试验

2 结果与分析

2.1 蔗糖浓度对三七幼叶细胞悬浮培养影响试验结果

实验结果显示：MS+2 mg/L 2,4-D +1 mg/L KT + 28 g/L蔗糖，pH 为5.8的培养基中细胞干重净增量最大，见表3所示.从表3可知,在蔗糖浓度小于28 g/L时随着蔗糖浓度的增长，细胞干重净生长量也随之增长，在28 g/L时增长量达到最大，此时蔗糖浓度如果再继续增加，就会产生抑制作用.

表3 蔗糖浓度对三七幼叶细胞悬浮培养影响试验结果

2.2 激素浓度对三七幼叶细胞悬浮培养影响试验结果

激素浓度对三七幼叶细胞悬浮培养影响试验结果显示，在编号为5的实验中干重净生长量均占优势，其激素配比均为1.5 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L KT，而a组5号实验结果又高于b组实验结果.由此可以得出，文山三七幼叶愈伤组织细胞在MS+1.5 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L KT +28g/L蔗糖，pH为5.8的培养基中更适合生长，见表4.

表4 激素浓度对三七幼叶细胞悬浮培养影响试验结果

3 结论

细胞培养过程中碳源、激素的种类和浓度配比情况都直接影响细胞培养效果.本试验在已有的研究基础上得到最适合文山三七幼叶愈伤组织细胞悬浮培养的培养基为MS+1.5 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L KT+28 g/L蔗糖，pH 为5.8.本实验采用的碳源是蔗糖，研究结果显示，在蔗糖浓度小于28 g/L时随着蔗糖浓度的增长，细胞干重净生长量也随之增长;在28 g/L时达到最大增长量，此时蔗糖浓度如果再继续增加，就会产生抑制作用，结果与已有研究基本相似.然而在周立刚[5]等人的研究中，用椰乳等其他物质代替蔗糖，也能取得优良效果.

在植物细胞培养过程中不含2,4-D的培养液完全不能建立悬浮细胞系，2,4-D浓度过低不利于悬浮细胞系的分散，过高又会使内含物减少，不利于体细胞胚胎的发育.KT也是促进细胞良好增殖发育不可缺少的[5],在研究和实践中常将两种激素配合使用.本试验主要研究2,4-D和KT对三七幼叶细胞培养的影响，结果显示1.5 mg/L 2,4-D +1.0 mg/L KT 对三七幼叶细胞生长比较有利.所以就细胞生长来说是最适合的激素浓度组合.然而细胞培养的目的是为了研究三七生理、遗传、药理性能，收获细胞培养产物，提高细胞代谢效率等.本试验得到的激素浓度组合不一定满足这样的要求.

细胞培养过程中所用的愈伤组织质量、培养基类型、培养基成分、培养初始接种量、培养液pH值、培养传代周期、培养温度、CO2浓度、空气湿度，甚至是无菌条件、设备、试剂、实验人员的操作技术等都会影响培养结果.本试验仅仅选取蔗糖和2,4-D,KT进行简单研究，对文山三七幼叶愈伤组织的细胞悬浮培养的研究道路还很长，研究任重道远.

[1] 何晶.三七的药理作用及研究进展[J].天津药学,2004,16(5):58-59.

[2] 杨志刚, 陈阿琴, 俞颂东. 三七药理研究新进展[J]. 上海中医药杂志,2005,39(4):59-62.

[3] 王艳, 武阳阳, 葛锋,等.三七细胞悬浮培养过程中皂苷生物合成的动力学变化[J]. 中药材，2013,36(7):1060-1062.

[4] 吴春霞.植物细胞悬浮培养的影响因素[J].安徽农业科学，2009,37(1)：36-38.

[5] 周立刚, 郑光植, 甘烦远,等.三七细胞悬浮培养的研究[J].植物学报，1992, 34(8):609-613.

2015-11-02

西北民族大学2015年国家级大学生创新创业训练计划项目(项目编号：201510742080).

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李涛(1992—), 男(彝族), 云南文山人.

Q811.9

A

1009-2102(2015)04-0061-03