我国新生牛血清60Coγ-射线照射技术的研究现状

2015-02-21马卫国王家敏马桂兰冯玉萍马忠仁乔自林

西北民族大学学报（自然科学版） 2015年4期

关键词：细胞培养噬菌体射线

马卫国，王家敏，马桂兰，冯玉萍，马花，马忠仁，乔自林*

(1．西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州730030；2.兰州民海生物工程有限公司，甘肃兰州730010)

我国新生牛血清60Coγ-射线照射技术的研究现状

马卫国1，王家敏1，马桂兰2，冯玉萍1，马花1，马忠仁1，乔自林1*

(1．西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州730030；2.兰州民海生物工程有限公司，甘肃兰州730010)

新生牛血清是医药生物技术产品重要的原辅材料，其质量是生物制品质量保证的重要环节，国内的新生牛血清用60Coγ-射线照射已有多年，但还没有形成统一的操作规范和技术标准.文章对我国新生牛血清60Coγ-射线照射的现况进行了分析总结，同时呼吁有关部门加强监督管理和技术指导，使60Coγ-射线照射技术在新生牛血清中得到更规范的应用.

新生牛血清；60Coγ-射线；研究现状

新生牛血清(newborn calf serum NBCS)是指出生14小时内未进食的健康新生牛采集分离的血清原料经进一步精制而成，主要用于动物细胞培养，与基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等技术有着密切的关系，是生物医药技术产品的重要原辅材料之一[1，2].在细胞培养中使用新生牛血清可以供给细胞增殖和维持生长所需的营养成分和生物因子，但是新生牛血清来源于自然生物体新生牛，牛本身携带和采集加工过程有污染外源微生物和致病因子的可能，因此，使用新生牛血清存在生物安全风险.在保证细胞培养效果的前提下，现阶段普遍采用的多级高效膜过滤系统能有效拦截新生牛血清中的细菌、真菌和支原体等微生物，但对病毒等更小的致病因子仍无法完全去除.为此，美国药典和欧洲法典要求对牛血清(包括胎牛血清和小牛血清)用56 ℃30 min灭活或30～45 kGy剂量的γ-射线照射，而且认为这个剂量的γ-射线照射可消除外源性有害生物，但不会改变血清的理化性质和对细胞培养的影响[3～6].由于我国新生牛血清在采集牛龄、牛源品种、营养状况以及血清的包装物与美国和欧洲有差别，辐照的剂量不应与其完全一致.为建立符合我国实际的辐照参数，国内新生牛血清生产厂家和使用单位从上世纪90年代就开始了辐照与灭菌、外源物消除、细胞培养效果等方面的研究工作，并取得大量的实验数据，为新生牛血清的辐照工艺提供了参考依据.

1 60Co γ-辐照灭菌的机制和应用范围

60Co γ-辐照灭菌由来已久，是由Mink在1896年提出来的，辐照灭菌最早用于保藏食品，1930年在美国就有相关专利获批.60Coγ-射线辐照灭菌是利用电离辐射产生的电磁波杀死大多数微生物的一种有效方法，用于灭菌的射线有电子束、X-射线和γ-射线等.X-射线和γ-射线能使其他物质氧化或产生自由基(OH·H)，再作用于生物分子，或者直接作用于生物分子，打断氢键、使双键氧化、破坏环状结构或使某些分子聚合等方式，破坏和改变生物大分子的结构，从而抑制或杀死微生物[7].辐照灭菌技术为冷灭菌，已日益广泛地应用于食品保鲜、卫生材料和手术器械灭菌.20世纪70年代，60Coγ-辐照灭菌技术被引进到我国，很快被应用于中西药制剂和医疗器械的灭菌.在20世纪90年代得到更广泛和深入的研究，在辐照的剂量及辐照对制品的质量和作用的影响做了量化的研究，如1997年卫生部发布了中药《60Co辐照灭菌标准》，使这项技术更好地为生产生活服务[8].

2 60Coγ-射线辐照新生牛血清的优势

60Coγ-射线辐照冷灭菌，对冷冻状态存贮的新生牛血清不需要加温和加压等过程，既达到了灭菌和破坏病毒原微生物的目的，又最大限度地保留了血清中培养细胞所需的蛋白质、多肽、激素、生长因子和其他有益成份不受破坏.60Coγ-射线的穿透力强、消毒均匀、杀菌彻底，能够达到产品深处及大包装产品内部，不受产品的结构、形态和包装的影响[9～10]，特别适宜对已密封包装的新生牛血清进行最后处理工序，避免了生产过程中的二次污染，方法快捷方便，这是普通灭菌法无法达到的.60Coγ-射线辐照适合批量连续作业，无残留、能耗少、成本低、速度快、操作简便，可实现规模化生产.

3 研究现状

我国新生牛血清60Coγ-射线辐照应用最早为傅牧等[11]，用剂量300万rad(约29.4 kGy)60Coγ-射线辐照后配制成牛睾丸细胞生产猪瘟细胞苗的维持液，并生产了5批产品，用未照射的同批次血清作对照，进行了收液效力、疫苗效力和保存期效检等检验.结果显示，收液效力与对照组差异不明显(P>0.05)，疫苗效力和保存期效检均达到当时的《规程》要求.解决了当时困扰新生牛血清中有零星微生物污染而正常抽检不易检出造成影响最终产品产量和质量的问题，也为我国新生牛血清γ-射线辐照技术的应用提供了实践证明，使一部分新生牛血清生产企业在产品出厂时就经过γ-射线辐照处理，从源头上保证了生物制品生产中最难控制的原辅材料的无菌.1991年刘桂芳等[12]对6批无菌、BVDV和BT细胞CPE阳性的新生牛血清用不同剂量的60Coγ-射线辐照后检测，结果显示，当剂量为4.642 kGy时，细菌和霉菌仍为阳性，剂量上升到5.972 kGy 时，其中3批细菌和霉菌由阳性变成阴性，剂量达8.145 kGy时全部为阴性，且在这个剂量时6批新生牛血清的BT细胞CPE和BVDV均变为阴性；用32.5 kGy辐照后的新生牛血清对VERO细胞培养没有影响，对BHK21细胞生长影响较大.

进入21世纪以来，辐照剂量控制技术日趋成熟，60Coγ-射线辐照新生牛血清研究工作趋于完善，新生牛血清的膜过滤技术也完全成熟，成品新生牛血清中无菌基本控制到了零污染，新生牛血清射线辐照的目的是去除噬菌体、支原体和病毒等更小的致病因子，以及对细胞培养生产功能影响的研究.姚伟等[13]用20、30和40 kGy60Coγ-射线照射新生牛血清，并以加热灭活的新生牛血清为对照培养了CHO-C28细胞.结果发现，在培养前期辐照组的细胞贴壁和生长增殖效果均优于对照组.在培养中期，辐照剂量为20 kGy的新生牛血清培养的细胞生长增殖和分泌HBsAg与对照组接近，两者无明显差异(P>0.05).当照射剂量≥30 kGy时，则抑制细胞分泌HBsAg，与对照组相比有明显差异(P<0.05).而且还发现辐照三个剂量能消除新生牛血清中的热原，但热灭活的对照组热原并没有消除.李明生等[1]将已知大肠杆菌噬菌体为阳性的同批新生牛血清用4、8、12、18、24、28、32、40、44和48 kGy的60Coγ-射线辐照后检测，结果显示，辐照对总蛋白含量无显著性差异(P>0.05)，当剂量≥8 kGy时，噬菌体变为阴性；当剂量≥18 kGy时培养Vero细胞的最大增殖浓度随剂量的增大而降低.李玉凡等[15]对8批初制新生牛血清用5、10和15 kGy60Coγ-射线辐照后检测，结果显示，内毒素定性检测辐照前后一致.噬菌体定性检测在剂量5 kGy辐照前后一致，剂量达到10 kGy时噬菌体变为阴性，培养SP2/0细胞的倍增时间辐照前后无显著性差异(P>0.05).李福安等[16]将检测牛腹泻病毒和大肠杆菌噬菌体阳性且细菌内毒素>10 EU/mL的10批新生牛血清用5、10 和15 kGy剂量60Coγ-射线辐照人后检测，结果表明，辐照剂量为5 kGy时仍有8批牛腹泄病毒阳性及6批大肠杆菌噬菌体阳性.10 kGy时牛腹泻病毒和大肠杆菌噬菌体均变为阴性，15 kGy时细菌内毒素仍全部>10 EU/mL.2011年李福安等[17]又对检测牛腹泻病毒阳性的8批新生牛血清用10 kGy剂量60Coγ-辐照后检测病毒，并与没有辐照处理的同批次血清对照进行了细胞培养验证.结果表明，在10 kGy时牛腹泻病毒全部杀灭，辐照前后培养SP2/0细胞的倍增时间均数无显著性差异(P>0.05).2013年王杰等[18]对4批新生牛血清分别用 8、10、15、20、25、30和40 kGy60Coγ-射线辐照后检测，结果显示所有批次处理后细菌、霉菌和支原体均呈阴性.当辐照剂量25 kGy 及以下时,原代CEF 细胞、Marc- 145细胞和ST细胞生长状态良好，剂量25 kGy以上时,细胞就开始脱落，并且随着剂量升高，脱落更严重；当辐照剂量20 kGy时,对伪狂犬病毒繁殖无显著影响，但对蓝耳病病毒繁殖有影响.2015年武汉生物制品研究所赵新华等[19]对供应商提供的成品新生牛血清用8和16 kGy60Coγ-射线辐照，与56 ℃30 min热灭活的和未做处理的同批次新生牛血培养VERO和MRC-5细胞，从细胞形态、倍增时间和维持细胞存活时间等三个指标进行检查.结果表明，未处理的血清最好，热灭活的最差，辐照处理的在两者之间，而且辐照剂量高的不如剂量低的.

4 结论

60Coγ-射线辐照对新生牛血清的灭菌效果，尤其是对噬菌体、病毒、支原体及外源因子的去除，表现出了它的优越性，已经在新生牛血清生产技术上起到重要补充和完善作用.现阶段新生牛血清生产企业为提高产品的质量和消除生物安全风险，供应给用于人用生物制品生产的新生牛血清大多数是经过辐照的，各生产企业辐照的剂量没有统一标准，而且产品上普遍没有明示是否经过辐照，也有可能在不知情的情况下,造成重复辐照后用物研究和生产的情况，使之辐照过量而引起品质下降和资源浪费.新生牛血清为《药典》收录的原辅料品种，希望有关部门牵头为该品种制订辐照要求和技术指南，使60Coγ-射线照射技术在新生牛血清中得到更规范的应用.

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(2010年三部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010,附录113.

[2] 董关木.细胞培养用牛血清的现状与进展[J].中国生物制品学杂志,2007,20(9):697-700.

[3] The United States Pharmacopeial Convention.The United States Pharmacopeia -National FormularyUSP38/NF33 Volume 1[M]. Maryland. The Board of Trustees.2015. <1024>Bovine Serum.719-732.

[4] The United States Pharmacopeial Convention.The United States Pharmacopeia -National FormularyUSP38/NF33 Volume 1 [M]. Maryland. The Board of Trustees. 2015.<90>Fetal Bovine Serum-Quality Attributes and Functionality Tests.167-170.

[5] European Pharmacopoeia Commission.European Pharmacopoeia. general monographs. Volume 1[M]. The Directorate for The Quality of Medicines & Healthcare of The Council of Europe. Germany. 2013.Bovine Serum.1686-1687.

[6] Andrej Trampuz, Kerryl E. Piper,1 James Metal,Effect of gamma irradiation on viability and DNA of Staphylococcus epidermidis and Escherichia coli[J].Journal of Medical Microbiology 2006( 55): 1271-1275.

[7] 李文全,涂瀛,陈世祺,等.γ射线对短小杆菌E601芽孢杀灭机理的初步研究[J].中国消毒学杂志,1996,13(3):129.

[8] 王锦燕.60Co-γ辐照灭菌在中药及其制剂中的应用[J].现代中药研究与实践, 2003,19(6):59-61.

[9] 施培新.食品的卫生安全性食品辐照加工原理与技术[M]. 北京:中国农业科学技术出版社,2004.53-80.

[10] 张奇志,王文亮,王守经,等.γ射线辐照技术对中药灭菌的应用研究进展[J].中国现代药物应用,2007,1(1):62-63.

[11] 傅牧,高永锐,孙建华等.用经钴-60射线辐照处理的犊牛血清生产猪瘟细胞苗的初步试验[J].中国兽药杂志,1990,12：9-11.

[12] 刘桂芳,路瑞坛,张瑞婷等.Co-60 γ射线辐照新生牛血清试验[J].中国兽药杂志,1999,25(4):18-20.

[13] 姚伟,李玉,林杰.60Coγ射线照射的新生牛血清对培养细胞的影响[J].药物生物技术,2002,9(6):356-358.

[14] 李明生，冯若飞，乔自林，肖树萍，李雪妮，马祺.60Coγ射线辐照对新生牛血清总蛋白含量、噬菌体及促Vero细胞生长的试验研究[J].西北民族大学学报,2004,25(55):72-74.

[15] 李玉凡,李福安,杨平学.60Coγ照射处理小牛血清的效果观察[J].工业卫生与职业病,2008,34(3):180-181.

[16] 李福安,李玉凡,鲍松滨.辐照小牛血清对生物指标影响的初步探讨[J].中国辐射卫生,2010,19(3):354-355.

[17] 李福安,于伟,李玉凡.辐照对小牛血清中牛腹泻病毒去除效果评价[J].中国公共卫生,2011,27(1):124.

[18] 王杰,张健.60Coγ射线辐照的犊牛血清对细胞培养及病毒增殖的影响[J].畜牧兽医科技信息, 2013,(1): 30-32.