绵羊脂联素受体2基因生物信息学分析

欧阳霞辉，徐红伟，张德荣1，，令世鑫1，，冯若飞1，，李明生1，，乔自林1，，马忠仁1，，柏家林1，*

(1.甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州730030；2.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州730030；3.西北民族大学实验中心，甘肃兰州730030)

绵羊脂联素受体2基因生物信息学分析

欧阳霞辉2，徐红伟3，张德荣1，2，令世鑫1，2，冯若飞1，2，李明生1，2，乔自林1，2，马忠仁1，2，柏家林1，2*

(1.甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州730030；2.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州730030；3.西北民族大学实验中心，甘肃兰州730030)

采用生物信息学方法对绵羊(兰州大尾羊)AdipoR2基因及其所对应蛋白质进行了分析.结果显示，AdipoR2基因全长1 809 bp，编码386个氨基酸多肽蛋白.核苷酸和氨基酸的同源性与山羊最高，分别为99.1%和99%，非洲爪蟾最低，分别为68.2%和78.5%.兰州大尾羊AdipoR2编码蛋白二级结构中α-螺旋占23.06%，β-片状占27.72%，无规则卷曲占49.22%.ADIPOR2蛋白为跨膜蛋白，N-端位于胞内，C-端位于胞外，由7个跨膜结构域组成.分析表明，绵羊AdipoR2基因由7个外显子和6个内含子组成，核苷酸序列变异以转换为主，转换/颠换比值为2.072.不同物种间绵羊与山羊AdipoR2核苷酸序列间变异最小(0.9%).系统发育分析表明，绵羊与山羊也首先聚为一类，推测绵羊与山羊的分歧时间大约在0.225百万年前.这些结果为进一步分析绵羊脂联素受体2(AdipoR2)基因功能及其所介导的脂联素功能奠定了理论基础.

脂联素受体2 基因；生物信息学；兰州大尾羊

脂联素(Adiponectin)是脂肪细胞所分泌的若干细胞因子中含量最高、迄今为止所发现的惟一与肥胖呈负相关的细胞因子，脂联素能够抗糖尿病[1～8]和抗动脉粥样硬化[4～5].肥胖症、胰岛素抵抗患者和II型糖尿病人血液中脂联素含量呈下降状态[2].增加小鼠体内脂联素含量能降低血糖和改善胰岛素抵抗[5～7].相反，脂联素不足则表现出胰岛素抵抗和糖尿病[8～9].脂联素主要通过激活AMPK[6～7]和PPARα[1],[2],[8]，以增强脂肪酸氧化及葡萄糖吸收，从而起到胰岛素增敏作用，而其作用发挥需要受体介导.脂联素受体有受体1(Adiponectin receptor 1，AdipoR1)和受体2(Adiponectin receptor 2，AdipoR2)两种，AdipoR1在肌肉组织表达最高，而AdipoR2在肝脏组织表达最高[8].AdipoRs含有七个跨膜结构域，但结构和功能上完全不同于G蛋白偶联受体[8].AdipoR1与球状脂联素结合、AdipoR2与全长脂联素结合，从而引起AMPK[6～7]增加和PPARα[8]激活以及脂肪酸氧化和葡萄糖吸收增加[10].目前，AdipoRs可作为研究抗糖尿病和抗动脉粥样硬化新药的靶分子.动物生产中脂联素及其受体基因可能是控制畜禽脂肪性状的主效基因或与控制该性状的主效基因相连锁，在动物分子育种实践中可作为一个新的分子标记.目前，人、猴、猪、牛、鸡、大鼠、小鼠、非洲爪蟾、斑马鱼等物种脂联素及其受体基因已被克隆，部分物种基因已定位于特定染色体上，并对其功能进行了研究[11]，绵羊AdipoRs基因克隆及其相关功能研究尚未见报道.Philip等研究表明脂联素受体能激活PPARα、AMPK、p38 MAPK[12]；Takashi和Toshimasa通过microRNA表达或抑制AdipoRs证明, AdipoRs介导球形结构脂联素或全长脂联素以增加PPARα和AMPK活性，进而在增加脂肪酸氧化和葡萄糖摄取中发挥作用[10]；在模拟转染C2Cl2肌细胞中, AdipoRs能增强AMPK、乙酰辅酶A羧化酶 (ACC)[7]和p38促分裂原活化蛋白激酶 (p38MAPK) 的磷酸化[12]，而其他的蛋白激酶 (如MAPK)却不会被磷酸化[8], 具体机制尚不清楚.Ding等 (2004)[13]克隆了猪脂联素Adipo1和AdipoR2 1 128 bp和1 161 bp的全长编码区cDNA序列，表明猪脂联素可能具有与人和其他哺乳动物相似的生理功能.Dai等[14]克隆表达猪脂联素及其两受体基因并对其进行染色体定位，得到基因图谱，对以后研究这3个基因功能、基因与脂肪代谢、与疾病的关系都有非常重要意义.Ramachandran等[15]研究发现, 鸡禁食48 h后, 脂肪组织中AdipoR2表达量明显增加, 而脑下垂体中的AdipoR2表达量却显著下降, 两受体在肝脏和间脑中都没有变化，脂联素也伴随着下降, 推测AdipoR2基因表达可能受血清中胰岛素水平影响.Tabandeh等[16]研究了不同生长发育阶段脂联素及其受体基因在奶牛卵巢细胞中的表达.本研究拟通过对项目组克隆的兰州大尾羊AdipoR2基因全长cDNA的生物信息学分析，以期为进一步研究其功能及其所介导的脂联素的功能奠定理论基础.

1 材料和方法

1.1 材料

数据来源于GenBank：绵羊(KF921623)、山羊(JX573540)、牛(NM_001040499)、马(NM_001163830)、恒河猴(NM_001266618)、人(NM_024551)、小鼠(NM_197985)、大鼠(NM_001037979)、猪(NM_001007192)、鸡(NM_001007854)和非洲爪蟾(NM_001094102).

1.2 方法

利用DNAstar 5.02 (DNASTAR Inc.，1996)软件对项目组克隆的兰州大尾羊AdipoR2基因序列(KF921623)和GenBank中其他物种序列进行对比分析、对位排列，计算序列间核苷酸差异百分比；采用MEGA5.1软件统计序列间转换/颠换(Ts/Tv)比值，邻接法(Neighor-joining method)构建系统发育树，自举分析(Boststrap test)通过1 000次重复抽样检验获得.根据公式T=K/2r计算绵羊与其他物种间分歧时间，其中T、K、r分别表示分歧时间、序列差异百分比和碱基替换率[18].

利用 ExPASY中 ProtParam 程序预测AdipoR2基因编码的氨基酸序列的理化性质 (http://us.expasy.org/tools/protparam.htmL)；运用SignalP 4.0 预测信号肽区域(http://genome.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；运用 TMHMM 工具对蛋白质的跨膜结构进行分析(http://genome.cbs.dtu.dk/services /TMHMM /)；运用Self optimized prediction method (SOPM, IBCP-CNRS) (http://searchlauncher.bcm.tmc. edu/seq-search/struc-predict.html)软件预测蛋白质的二级结构.

2 结果和分析

2.1 绵羊AdipoR2基因核苷酸及氨基酸序列分析

绵羊AdipoR2基因全长1 809 bp, ORF为1 161 bp，起始密码子ATG位于205 nt～207 nt, 终止密码子TGA位于1 363 nt～1 365 nt，编码386个氨基酸.编码区两侧翼分别具有5’-UTR 204 bp(1～204 nt)和3’-UTR 444 bp (1 366～1809 nt)，终止信号AATAAA出现在1 493～1 498 nt.

绵羊AdipoR2基因核苷酸序列与山羊、马、牛、猪、恒河猴、人、小鼠、大鼠、鸡和非洲爪蟾的同源性分别为99.1%、96.5%、87.7%、88.0%、86.3%、86.0%、84.1%、84.1%、75.9%、68.2%.将AdipoR2 核苷酸序列与绵羊基因组序列比对，可知AdipoR2基因位于绵羊第3号染色体，由7个外显子和6个内含子组成(图1).绵羊AdipoR2基因编码386个氨基酸的多肽，分子量为43 622.5 Da，理论等电点为6.11，亲水性指数为90.8，不稳定指数为48.68，表明AdipoR2 为不稳定蛋白.AdipoR2多肽中碱性氨基酸占7.5%，酸性氨基酸占14.1%，疏水性氨基酸占48.4%，极性氨基酸占29.4%.信号肽分析表明，AdipoR2蛋白无信号肽，属膜结合蛋白.

SOPM预测兰州绵羊AdipoR2蛋白的二级结构中α-螺旋占23.06%，β-片状占27.72%，无规则卷曲占49.22%.AdipoR2为跨膜蛋白，N-端位于膜内，C-端位于膜外，由7个跨膜结构域(Transmembrane domain, TD)组成，从N-端到C-端分别为TD1(147～168 AA)、TD2(182～204 AA)、TD3(216～239 AA)、TD4(246～267 AA)、TD5(277～299 AA)、TD6(308～329 AA)、TD7(348～367 AA)(图2).绵羊AdipoR2蛋白质氨基酸序列与山羊(predicted:Xp_005681099)、牛(NP_001035589)、马(NP_001157302)、猪(NP_001007193)、人(NP_078827)、恒河猴(NP_001253547)、大鼠(NP_001033068)、小鼠(NP_0132102)、鸡(NP_001007855)、非洲爪蟾(NP_001087571)的相似度分别为99%、97.2%、92%、91.2%、91.2%、90.9%、89.4%、88.6%、81.9%和78.5%.

2.2 绵羊AdipoR2基因序列变异分析

绵羊与其他物种间AdipoR2基因序列差异百分比见表1.绵羊与山羊间有较高的遗传相似性，序列差异百分比在各物种间最小，为0.9%；恒河猴和人间的序列差异百分比为1.9%，遗传相似性仅次于绵羊和山羊；小鼠与大鼠、绵羊与牛、山羊与牛之间序列差异百分比分别为3.1%、3.4%和3.6%，位于第三.作为外类群的两栖类非洲爪蟾与各物种间序列差异百分比为31.0%～33.1%，平均为31.87%，序列差异百分比最大，表明遗传相似性最小.

2.3 基于AdipoR2基因序列的绵羊系统发育分析

采用NJ法构建的系统发育树见图3(图中枝长表示分歧度，节点的数值为1000次重复抽样检查的支持率).恒河猴和人首先聚为一支，节点的自举支持率为100%，然后与马聚为一类，节点的自举支持率为75%以上.小鼠和大鼠聚为一支，节点的自举支持率为100%；绵羊和山羊聚为一支，节点的自举支持率为100%，然后与普通牛聚为一类，节点的自举支持率也为100%.

本研究中各物种间AdipoR2核苷酸序列变异以转换为主，转换变异类型中以T/C转换为主，占34.98%；A/G转换占29.15%；在颠换变异类型中A/T、A/C、G/T、G/C颠换分别占8.73%、8.34%、9.60%和9.21%.绵羊及不同物种间AdipoR2基因的转换/颠换比值为2.072，大于转换/颠换比临界值2.0，表现出较高的转换偏爱性.根据每百万年2%的分子进化钟推测兰州大尾羊与山羊的分歧时间大约在0.225百万年前.

表1 基于绵羊脂联素受体2基因的核苷酸序列变异率 (%)

3 讨论

绵羊AdipoR2核苷酸序列相似性与山羊最高，为99.1%；与非洲爪蟾最低，为68.2%；与猪、牛、马、恒河猴、人、小鼠、大鼠、鸡介于96.5%～75.9%之间，表明AdipoR2核苷酸序列间具有较高的相似度.与山羊CDS核苷酸序列相比，在第87、162、807、828、876、1062位分别发生6次碱基转换和第742、960、1155、1161位分别发生4次碱基颠换，以及2次碱基缺失和1次碱基插入.除山羊CDS外，本研究中所涉及10个物种AdipoR2 CDS均长1 161 bp；山羊AdipoR2 CDS第1161位发生A→C碱基颠换，引起终止密码突变，使终止密码子TGA变成TGC，继续指导合成肽链延伸至第二个终止密码子GTA出现才结束，故山羊AdipoR2 CDS比其他物种长15 bp，为1 176 bp.这一序列是2013年8月31日提交GenBank的成都麻羊AdipoR2序列(JX573540)，而2013年9月30日GenBank中另一由基因组测序推测的云南黑山羊AdipoR2序列中其CDS却为1 161 bp (XM_005681042)，故山羊AdipoR2基因序列有必要进一步研究.

绵羊AdipoR2基因由7个外显子和6个内含子组成，与小鼠AdipoR2基因结构组成一样[17].绵羊AdipoR2 CDS编码386个氨基酸，其与山羊、牛、马、猪、人、恒河猴的相似度分别为99%、97.2%、92%、、91.2、91.2%、90.9%；与大鼠、小鼠、鸡、非洲爪蟾的相似度分别为89.4%、88.6%、81.9%、78.5%，表明AdipoR2蛋白氨基酸序列间具有较高保守性.预测的绵羊AdipoR2蛋白为跨膜蛋白，N-端位于膜内，C-端位于膜外，由7个跨膜结构域组成，人和小鼠AdipoR2蛋白也有7个跨膜结构域[8，10，17].因此，与Yamauchi等(2003)[8]、Kadowaki和Yamauchi[10]、王会中等[17]研究结果一致，绵羊AdipoR2跨膜蛋白在结构、功能上也不同于G蛋白偶联受体.

AdipoR2核苷酸序列变异分析表明绵羊与山羊间有较高的遗传相似性，序列差异百分比在各物种间最小，为0.9%.本研究中基于AdipoR2基因系统进化树也获得了相似结果，即绵羊和山羊间有较高遗传相似性.本研究中各物种间AdipoR2核苷酸序列变异以转换为主，转换/颠换比值为2.072，大于转换/颠换比临界值2.0，表现出较高的转换偏爱性(bias)，说明各物种间AdipoR2基因序列的突变未达到饱和状态，选择每百万年2%的分子进化钟[18].推测兰州大尾羊与山羊的分歧时间大约在0.225百万年前.与郭军等[19]对中国主要绵羊类群线粒体DNA研究结果中中国绵羊分化时间大约在0.21～0.32百万年前更新世大型食草动物物种爆发期的结论相一致.

4 结论

运用生物信息学方法分析了1 809 bp绵羊全长AdipoR2基因序列特征，并对其基因结构和所编码蛋白质结构、核苷酸序列变异和基于AdipoR2基因的绵羊系统发育进行了研究，为进一步研究脂联素受体功能及其所介导的脂联素作用及其应用提供了基础材料.

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Bioinformatics of adiponectin receptor 2 gene in sheep, Ovis aries

OUYANG Xia-hui2, XU Hong-wei3, ZHANG De-rong1,2, LIN Shi-xin1,2，FENG Ruo-fei1,2，LI ming-sheng1,2, QIAO Zi-lin1,2, MA Zhong-ren1，2，BAI Jia-lin1，2

(1.Gansu Engineering Research Center，Lanzhou 730030,China；2.College of Life Science and Engineering, Northwest University for Nationalities, Lanzhou 730030;3.Experimental Center, Northwest University for Nationalities, Lanzhou 730030,China)

We analyzed the gene structure of adiponectin receptor 2 (AdipoR2) of Lanzhou fat-tailed sheep and its encoded protein characteristics using bioinformatics method. The full length cDNA of AdipoR2 is 1 809 bp and its open reading frame is 1 161 bp in length, encoding a mature protein of 386 amino acids and resulting Mr=43 622.5. The sheep nucleotide sequence shares maximum (99.1%) and minimum (68.2%) homology with goat and African clawed frog, and 99% and 78.5% similarity with goat and frog proteins at the amino acid level. Predicted secondary structure of AdipoR2 contains 23.06% alpha helix, 27.72% extended strand and 49.22% random coil. AdipoR2 protein appears to be integral membrane protein; the N terminus was internal, and the C terminus was external, which is predicted to contain seven transmembrane domains, but are structurally, topologically and functionally distinct from G protein coupled receptors. The genomic DNA of AdipoR2 includes seven exons and six introns. The nucleotide divergence percent of AdipoR2 between sheep and goat was minimum. Meanwhile, sheep and goat was also initially clustered in one group. Maximum composite likelihood estimate of the pattern of nucleotide substitution showed that transition/transversion (Ts/Tv) rate of AdipoR2 among different species was 2.072, higher than the critical value 2.0 and showed higher transition bias, speculating divergence time between sheep and goat was 0.225 MYA. These findings would be the basis of further study the function of AdipoR2 in sheep.

Adiponectin receptor 2 (AdipoR2) gene; bioinformatics; Lanzhou fat-tailed sheep

2015-11-20

国家自然科学基金项目(31260533)；甘肃省自然科学基金项目(1208RJZA188)；甘肃省科技支撑计划项目(1204FKCA182).

*

欧阳霞辉(1978—)，女，甘肃靖远人，副教授,博士，主要从事动物生殖与发育方面的研究.

S826

A

1009-2102(2015)04-0045-06