DNA分子标记检测方法及在茶树中的研究进展

刘振，赵洋，杨培迪，成杨，宁静，杨阳

DNA分子标记检测方法及在茶树中的研究进展

刘振，赵洋，杨培迪，成杨，宁静，杨阳*

（湖南省茶叶研究所，湖南 长沙 410125）

DNA分子标记检测方法是分子标记研究中的一项重要技术，直接关系到分子标记研究的效率、准确性和成本等。本文概述了现有DNA分子标记检测方法的种类及技术原理、特点和应用情况，综述了DNA分子标记检测方法在茶树中的应用并探讨了其发展前景，为茶树DNA分子标记检测方法的研究提供参考。

DNA分子标记；检测方法；茶树；综述

DNA分子标记检测方法是将不同分子标记的差异片段通过电泳等技术检测出来的方法，它是分子标记研究中的一项重要技术。分子标记技术的发展促进了分子标记检测方法的不断完善。现有的分子标记检测方法根据原理不同分为琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、高分辨率熔解曲线分析、微流控芯片电泳等。茶树[Camellia sinensis (L.) O.Kuntze]是一种山茶科山茶属茶组（Sect. Thea (L.) Dyer in Hook.）的多年生经济作物。目前应用于茶树研究的分子标记有RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SSR、SRAP、SNP等，主要是进行茶树种质资源和遗传育种中的遗传多样性、亲缘关系分析、起源与演化、种质鉴定、遗传图谱构建、性状连锁标记筛选等方面的研究[1-3]。本文综述了不同分子标记检测方法的原理、特点及其应用，综述了分子标记检测方法在茶树中的研究现状，探讨了其发展前景，进而为茶树分子标记检测方法研究提供参考。

1 DNA分子标记检测方法种类

1.1 琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳（Agrose gel electrophoresis，AGE）是以琼脂糖凝胶为支持物的电泳方法，因其具有操作简单、经济、便捷等特点，是目前常用的扩增产物分析检测技术。但是琼脂糖凝胶电泳的最大缺陷是检测的灵敏度和分辨率较低，有效分离范围是0.2～2 kb，即使采用3%的琼脂糖凝胶，估计的片段大小也有8bp的误差[4]，很难区分差异较小的片段。同时，传统的染料溴化乙锭（EB）具有强致癌性，长期接触对实验人员身体有害。目前已开发了如SYBR Gold，SYBR Green I，GoldViewnaII，Gelview，GelGreen，GelRed等安全且灵敏的EB替代品，EB替代品不断更新，促进了琼脂糖凝胶电泳在分子标记研究中的应用。由于琼脂糖凝胶电泳的低灵敏度和分辨率，其主要用于RFLP、RAPD、AFLP、ISSR等差异片段间差异较大的分子标记方法[5]。

1.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamidc gel electrophoresis，PAGE）是由丙烯酰胺单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺通过化学催化剂过硫酸铵（AP）和四甲基乙二胺（TEMED）催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚丙烯酰胺凝胶电泳作为分子标记研究中应用范围最广的一种检测方法，其具有以下优点：（1）分辨率较高。聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳的显著优点是更高的分辨率，可有效区分1～500 bp的核苷酸片段；（2）成本低。聚丙烯酰胺凝胶电泳所用的试剂价格低，所配套的仪器已完全实现了国产化，可以满足普通实验室的承受能力。但是聚丙烯酰胺凝胶电泳也有其自身缺陷：（1）检测耗时耗力。通常在10%的凝胶电泳下所需的检测时间大于2 h，同时加上银染、显色的时间，一批电泳要耗时3 h以上，而琼脂糖凝胶电泳则只需1 h；（2）分析样本量有限。以SSR标记为例，一般的电泳槽最大样本量为100左右；（3）操作复杂。该实验包括洗板、配胶、做胶、上样、染色、显色、拍照等一系列手工操作步骤，操作程序复杂，对操作人员的经验和熟练程度要求较高；（4）不同批次数据整合困难。由于聚丙烯酰胺凝胶电泳的片段大小是依据Marker估计出的片度大小，如何准确地整合不同批次品种DNA的标记数据一直是个难题[6,7]；（5）实验安全风险大。丙烯酰胺是一种神经毒剂，长期接触可对人体健康造成危害。聚丙烯酰胺凝胶电泳虽有较多的缺点，但是作为一种分辨率高、成本低的分子标记方法，已广泛的应用于包括RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SSR、SRAP等目前主要的分子标记研究中。

1.3 毛细管电泳

毛细管电泳（Capillary elcctrophorcsis，CE）是一种近年发展起来的新型电泳技术，属于电泳与色谱技术的交叉应用[6]。它以毛细管为通道，在高压直流电压作用下促进物质在毛细管内迁移并分离。与传统的凝胶电泳检测不同，毛细管电泳荧光检测以峰的形式表现，而不是以谱带的形式表现。毛细管电泳用于扩增片段检测分析时，须用FAM（6-carboxy-fluorescein）、TEX（tetmehlom-6-earboxy-fluoreseein）和HEX（hexachloro-6-earboxy—fluoreseein）等不同颜色的荧光染料标记引物，利用DNA测序仪对不同荧光标记、扩增片段范围不同的PCR产物进行SSR荧光标记的全自动分析，利用电脑软件进行数据整理和分析，精确计算出扩增片段的大小，实现了分子标记与毛细管电泳技术的结合[8]。

毛细管电泳的主要优点是：（1）能够准确读出扩增等位基因的大小，便于多批次的数据采集和分析；（2）高通量检测。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法在利用一套电泳设备情况下，每人每天最多可检测200个样品。基于ABI 3130 XLDNA测序仪，在一种荧光标记毛细管电泳的情况下，每次可同时检测16个样品，耗时约0.5 h，每人每天可检测768个扩增产物。若同时采用4种荧光标记进行毛细管电泳，则每人每天可检测3072个扩增产物。由此可见，荧光标记毛细管电泳检测效率要远高于常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测技术，在样品数量较大时，优势更明显[7]；（3）利用与遗传分析系统相匹配的计算机软件对数据进行统一处理，操作简便，实现了分子标记研究的高效与自动化。毛细管电泳虽优势明显，但也有其缺点：（1）成本高。DNA测序仪价格昂贵，并不是一般实验室都有能力配备。同时，荧光标记引物的合成费用相对较高，而且保存时间只有1年，而一般引物可保存3年左右。（2）异常峰。电泳检测结果中偶尔会出现异常峰，在一定程度上降低了数据的准确性和可靠性[8,9]；毛细管电泳作为一种新型电泳技术，因具有高效、自动化等优点，已在烟草、水稻、豌豆、大麦、油菜等植物的遗传研究中有了广泛的应用[10-12]，其中最多的是同SSR分子标记结合，开展不同作物毛细管电泳技术的优化与品种的鉴定等研究[13,14]。

1.4 高分辨率熔解曲线分析

高分辨率熔解曲线分析（High resolution melting curve analysis，HRM）是在饱和荧光染料和高精度荧光定量PCR仪基础上发展起来的一项新型基因分型技术。HRM的主要原理是利用特定的荧光染料可插入DNA双链中，在双链升温的过程中DNA双链解链熔解、荧光减弱，在变为单链时较为急剧，不同DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，从而形成不同熔解曲线，进而直观反映了目标DNA序列的变异[15]。对于非饱和荧光染料，在DNA双链熔解过程中，释放出的荧光染料可再次掺入未解链的DNA双链，使得荧光变化不能精确反映DNA序列的变异[16]。相反，饱和荧光染料可饱和的掺入DNA双链中，熔解过程中释放的荧光染料不会继续与DNA双链结合，所以荧光变化能够直观准确的反映DNA片段特征[17]。

HRM的技术优势主要表现在以下方面：（1）分辨率高。可以检测出一个碱基的差异。赵均良等[18]通过PAGE与HRM技术对水稻分子标记基因型分析结果表明，对于PAGE不能分辨的标记，HRM能清晰分辨。毛细管电泳技术与高分辨率熔解曲线分析的检测效率研究结果表明，高分辨率熔解曲线分析具有较高的核苷酸多态性检测能力，在同一物种的不同品种间的检测结果更加准确，效率更高[19]；（2）高通量。1次可同时检测10～384个样本；（3）高效省力。所有的实验操作可在2 h内完成，且结果可由机器直接输出，方便、清晰；（4）准确性高。HRM是通过机器直接读数，避免了琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳对于一些“模糊”条带的判读受人为因素影响；（5）成本低。不需设计探针和进行引物标记，大大节约了引物开发成本。

高分辨率熔解曲线分析作为一种新型基因分型技术，在植物中的应用才刚刚起步，主要在种质鉴定、SNP标记开发、遗传图谱构建、突变扫描、基因分型等研究领域[19]。Mader等[20]首次成功的将高分辨率熔解曲线分析技术应用于牛至属的种质资源鉴定中，结果表明，该方法可有效的进行种质资源鉴别。朱岩芳[5]利用SSR高分辨率熔解曲线分析方法对Y两优689、株两优06、钱优l号和他们的两个亲本进行了鉴别，结果表明3个杂交品种与两亲本呈现完全不同的熔解曲线，高分辨率熔解曲线分析技术可有效的进行水稻品种的鉴别。兰青阔等[21]通过HRM分析和焦磷酸测序确认，获得3个SNP位点，并对市售的12个杂交黄瓜种进行分型鉴定，结果表明，3个SNP位点适用于其中11个市售品种的纯度鉴定。目前利用高分辨率熔解曲线分析进行遗传图谱构建和基因定位的植物包括白羽扇豆、二棱大麦、苹果和黑麦草等[22]。随着HRM技术的不断完善，高分辨率熔解曲线分析技术将会成为植物分子标记研究领域的热点[23,24]。

1.5 微流控芯片电泳

微流控芯片电泳（Microchip electrophoresis，ME）是一种采用微细加工技术，在几平方厘米的芯片上，制作电泳微流通道结构及其它功能单元，以实现集微量样品分离、检测于一体的微型实验室技术[25]。该技术产生于20世纪90年代，由Manz等最先提出“微全分析系统”的概念。与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，微流控芯片电泳可以仅消耗pL级样品，在数分钟甚至更短时间内完成上百个样品的分析，并且可以在线进行样品的预处理和全过程分析，此外，ME具有比荧光检测更高的灵敏度，结果更加精确。但是，微芯片电泳所需的成本高，首先微芯片电泳仪的价格昂贵；其次，实验所用的各种试剂盒价格也比较高，这些因素制约了微芯片电泳技术的普遍应用。

刘金华等[26]采用微流控芯片分析仪结合t检验进行分析，成功地鉴定了黄山松DNA多态性片段中的3个等位基因，认为该方法与一般的凝胶电泳技术比较，具有效率高、速度快、灵敏度好和样品用量少等优点，并且可同时完成定性定量分析，使获得的信息量和准确性有了较大提高。张莎莎等[27]采用微芯片电泳技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对玉米自交系8112等SSR分子标记的PCR扩增结果进行了比较，结果表明，微芯片电泳具有无毒性、操作简单、灵敏度和准确性高，重复性好等优点。目前微流控芯片电泳技术还处于不断的改进阶段，随着进样、分离和检测等系统的完善，微流控芯片电泳技术将在今后科研工作中拥有更加广阔的前景。

1.6 其他

伴随着SNP等第三代分子标记技术的兴起，与之相适应的检测技术也在近几年得到了快速的发展，目前进行SNP检测的方法主要有异源双链技术、变性的高效液相色谱法、变性梯度凝胶电泳、焦磷酸序列分析等[28]。但是，这些方法各有其优缺点，在实际应用中，可根据试验目的和具体需要，通过做预试验进行方法优选，或将不同方法结合应用，取长补短，进而取得理想的研究结果。随着计算机程序化分析的不断发展，各种检测技术的优化组合及新技术应运而生，可以预测，准确、快速、经济和有效将是未来分子标记检测手段发展的必然。

2 分子标记检测方法在茶树中的应用及展望

2.1 应用情况

琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是茶树分子标记研究中应用最广的检测方法。琼脂糖凝胶电泳由于分辨率低，对于检测等位位点相差几个碱基的特异标记比较困难，因此主要应用于茶树RFLP、RAPD、ISSR等标记的检测。随着AFLP、SSR、SCAR等特异分子标记在茶树中的应用，分辨率更高的聚丙烯酰胺凝胶电泳也开始广泛的应用于茶树分子标记研究中，该方法的应用极大的促进了茶树遗传背景研究、指纹图谱构建、关联标记筛选和遗传图谱构建等研究的开展[29]。聚丙烯酰胺凝胶电泳虽然相对琼脂糖凝胶电泳的分辨率有了很大提高，但是这种技术不能准确读出片段大小，并且试验周期长、操作复杂、样本量有限。伴随着荧光标记、SNP标记等新型标记技术在茶树中的应用，聚丙烯酰胺凝胶电泳已不能满足于相关试验的需要。为了促进荧光标记方法在茶树中的应用，黄建安等[30]采用TP-M13-SSR技术对42个茶树品种的16个SSR位点进行遗传分析的结果表明：此法具有简便、可靠、低成本及高通量的优点，且随着所分析SSR位点数的增加，降低成本的效果更加显著。同时，随着第三代分子标记SNP出现，为了促进SNP在茶树遗传育种中的应用，张成才等[31]使用SNaPshot技术对10个SNP在茶树品种中进行分型进行研究，结果发现6个SNP分型结果与测序结果一致，准确率为60%，表明SNaPshot技术对茶树SNP的分型准确性高、重复性好，可用于茶树遗传多样性分析以及茶树遗传图谱构建等方面的研究。

2.2 展望

每种检测方法都有其优缺点，因此不同研究可以根据自身试验目的和试验条件，在准确、实用、经济和快速的基础上，选择理想的分子标记检测方法。茶树种质资源丰富，随着茶树分子标记研究的深入，遗传作图、性状关联标记筛选等将是茶树分子标记研究的热点，而琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术等由于受分辨率低、操作复杂、有安全风险等限制，不仅不能满足于大规模样本量分析，而且不能满足SNP等第三代分子标记的研究需要，因此为了促进分子标记技术在茶树种质资源和遗传育种等方面的研究深入，茶树毛细管电泳、高分辨率熔解曲线分析和微流控芯片电泳等新型分子标记检测体系的建立与完善将成为茶树分子标记研究的热点。

[1] Yao M Z, Ma C L, Qiao T T, et al. Diversity distribution and population structure of tea germplasms in China revealed by EST-SSR markers [J]. Tree Genetics & Genomes,2012,(8):205-220.

[2] Fang W, Cheng H, Duan Y, et al. Genetic diversity and relationship of clonal tea (Camellia sinensis) cultivars in China as revealed by SSR markers[J]. Plant Syst Evol,2012,(298):469-483.

[3] Raina S N, Ahuja P S, Sharma R K, et al. Genetic structure and diversity of India hybrid tea[J]. Genet Resour Crop Evol,2012,(59):1527-1541.

[4] Vemireddy, Sunil A, Javaregowda N. Capillary electrophoresis is essential for microsatellite marker based detection and quantification of adulteration of basmati rice (Oryza sativa) [J]. J.Agric.Food Chem,2007,55(20): 8112-8117.

[5] 朱岩芳.农作物品种分子标记鉴定及指纹图谱构建研究[D].杭州:浙江大学,2013.

[6] 宋伟林.基于SSR荧光标记毛细管电泳的油菜品种DNA指纹鉴定技术平台的建立与应用[D].北京:中国农业科学院研究生院,2013.

[7] 程本义,夏俊辉,龚俊义,等.SSR荧光标记毛细管电泳检测法在水稻DNA指纹鉴定中的应用[J].中国水稻科学,2011,25(6):672-676.

[8] 易红梅.基于毛细管电泳荧光标记的玉米品种SSR高通量检测体系的建立研究[D].北京:首都师范大学,2006.

[9] 郝晨阳,王兰芬,贾继增.SSR荧光标记和银染技术的比较分析[J].作物学报,2005,31(12):144-149.

[10] 陈雅琼.基于SSR荧光标记和毛细管电泳检测技术的我国烟草审(认)定品种遗传多样性研究[D].北京:中国农业科学院,2011.

[11] 龚亚明，胡齐赞，毛伟华，等. EST-SSR荧光标记毛细管电泳检测法在豌豆上的应用及评价[J].浙江农业学报,2009,21(6):540-543.

[12] Studer B, Asp T, Frei U, et al. Expressed sequence tag-derived microsatellite markers of perennial ryegrass (Lolium perenne L.)[J]. Mol Breed, 2008,(21):533-548.

[13] Castillo A, Budak H, Varshney R K, et al. Transferability and polymorphism of barley EST-SSR markers used for phylogenetic analysis in Hordeum chilense[J]. BMC Plant Biol,2008,(8):97-105.

[14] Sharma V, Bhardwaj P, Kumar R, et al. Identification and cross species amplification of EST derived SSR markers in different bamboo species[J]. Conserv Genet,2009,10(3):721-724.

[15] Wilhelm J, Pingoud A. Realtime polymerase chain reaction[J].Chembiochem,2003,4(11):1120-1128.

[16] Giglio S, Monis P T, Saint C P. Demonstration of preferential binding of SYBR Green Ⅰ to specific DNA fragments in realtime multiplex PCR[J]. Nucleic Acids Research,2003,31(22):136.

[17] Mackay J F, Wright C D, Bonfiglioli R G. A new approach to varietal identiffcation in plants by mierosatellite high resolution melting analysis: application to the verification of grapevine and olive cultivars[J].Plant Methods,2008,4(1):8. [18] 赵均良,张少红,刘斌.应用高分辨率熔解曲线技术分析水稻分子标记基因型[J].中国农业科学,2011, 44(18):3701-3708.

[19] Ganopoulos I,Argiriou A,Tsaftaris A.Microsatellite high resolution melting (SSR-HRM) analysis for authenticity testing of protected designation of origin (PDO) sweet cherry products[J].Food Control,2011,22(4):532-541.

[20] 李潇,卢瑶.高分辨率熔解曲线分析技术及其应用进展[J].中国医学装备,2010,7(8):57-60.

[21] 兰青阔,张桂华,王永,等. 基于高分辨率熔解曲线技术快速筛选黄瓜SNP[J].分子植物育种,2011,9(5): 642-647.

[22] 甘四明,李发根,翁启杰.高分辨率熔解及其在植物DNA变异检测中的应用[J].基因组学与应用生物学(网络版),2010,(29):1-6.

[23] 谭昌渊，罗九甫，任兆瑞．高分辨率熔解曲线分析-分子诊断的新技术[J]．生命科学研究,2009,13(3): 268-271．

[24] Wu S B， Wirthensohn M， Hunt P, et al．High resolution melting analysis of almond SNPs derived from ESTs[J]．Theoretical and Applied Genetics，2008，118(1):l-14．

[25] 于冰,任玉敏,丛海林,等.微流控芯片电泳的研究进展[J].分析测试学报,2011,30(9):1067-1073.

[26] 刘金华,殷学锋,唐娟娟.微流控芯片快速鉴定黄山松DNA多态性片段[J].高等学校化学学报,2004,25(2): 270-272.

[27] 张莎莎,郭新梅,赵美爱,等.微芯片电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳的比较分析[J].中国农业科技导报, 2013,25(2):173-178.

[28] 王晓玲,马玉珍,旭日干.单核苷酸多态性检测技术的研究进展[J].生物技术通报,2006(6):64-67.

[29] Sui N, Ming Z Y, Liang C, et al. Germplasm and breeding research of tea plant based on DNA marker approaches[J].Front.Agric.China 2008,2(2): 200-207.

[30] 黄建安,李娟,谭月萍,等.毛细管电泳四色荧光检测法分析茶树SSR标记生命科学研究[J].2009,13(3): 251-257.

[31] 张成才,谭礼强,王丽鸳,等.SNaPshot技术检测茶树SNP研究[J].茶叶科学,2014,34(2):180-187.

Method for Detecting DNA Molecular Markers and Their Application in Tea Plant (Camellia sinensis)

LIU Zhen，Zhao Yang，YANG Pei-di，CHENG Yang，NING Jing，YANG Yang*
（Hunan Tea Research Institute，Changsha，Hunan 410125，China）

Methods for detecting DNA molecular markers were an important technology in molecular marker studies, which directly related to the efficiency, accuracy, and the cost effectiveness of molecular marker studies. In this paper, the existing detection methods for DNA marker and their principles, characteristics and applications were summarized, and applications and prospects in tea plant were also reviewed to provide some references for their future researches.

DNA molecular markers; detection method; tea plant; review

S571.1

A

2015-02-16 初稿；2015-04-29 修改稿

现代农业产业技术体系建设专项（CARS-23）、湖南省科技重大专项（2014FJ1006）

刘振（1981-），男，助理研究员，研究方向为茶树种质资源与遗传育种。

*通讯作者：杨阳（1963-），男，研究员，研究方向为茶树种质资源与遗传育种，E-mail: yangyangsir@126.com