HPLC 法测定5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛有关物质

蒙发明 李敏英

（中山奕安泰医药科技有限公司 广东中山 528437）

TAK438 为日本武田与2014 年3 月3 日向日本劳动卫生福利部（MHLW）提交了实验性胃酸分泌抑制剂TAK-438（通用名：vonoprazan 富马酸）的新药申请（NDA），该药属于钾离子（K+）竞争性酸阻滞剂（P-CAB）的新一类抑制剂[1]，具有强劲、持久的胃酸分泌抑制作用，同时，在胃壁细胞胃酸分泌的最后一步中，通过抑制K+对H+,K+—ATP 酶（质子泵）的结合作用，对胃酸分泌也具有提前终止作用。TAK06（CAS 号：881674-56-2）是合成TAK-438(富马酸沃诺拉赞)的关键中间体，其分子式为C11H8FNO，化学名为5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛。TAK06 的质量直接影响TAK-438 的合成，为指导日常生产、控制产品质量，本文建立了测定TAK06 有关物质的方法。

一、 实验部分

1.仪器

安捷伦1200 高效液相色谱仪（配DAD 检测器）、梅特勒XS204 电子天平、艾科Exceed-Cd -24 纯化水机

2.试药及试剂

TAK06 对照品（自制，批号为TAK06-WRS，含最99.3%)，TAK06 杂质A（自制，批号为20150101），TAK06 杂 质B（ 自 制， 批 号 为20150102），TAK06杂 质C（ 自 制， 批 号 为20150103），TAK06 样 品（ 自 制， 批 号 为TAK06R150101，TAK06R150102，TAK06R150103）；乙腈（色谱纯）；甲酸（分析纯）；实验用水为纯化水。

二、方法与结果

1.色谱条件

色谱柱： 苯基柱(4.6*250mm,5um) ；流动相：流动相A 为0.1%甲酸水溶液，流动相B 为乙腈，梯度洗脱（见下表1）；检测波长：254nm ；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：20ul；理论板数按照TAK06 计不得低于3000，TAK06 主峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。

表1：流动相梯度洗脱

2.有关物质的测定

取TAK06 样品适量，用乙腈制成约0.1mg/ml 溶液，作为供试品溶液；精密取供试品溶液1ml,用乙腈稀释至100ml,作为对照溶液，取空白溶液、供试品溶液、对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，扣除空白，如果供试品溶液中有杂质峰，与对照溶液主峰面积比较，计算最大单个杂质及总杂质，单个杂质不得过0.5%，总杂质不得过2.0%。

3.有关物质方法的验证

（1）系统适应性：分别取TAK06 对照品、TAK06杂质A、TAK06 杂质B、TAK06 杂质C 适量，置于同一容量瓶中，用乙腈溶解混合溶液，作为系统适应性溶液。取空白溶液、系统适应性溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图（见下图）。结果表明，空白无干扰，出峰顺序为：杂质A、杂质C、杂质B、TAK06；系统适应性中4 种物质分离度符合要求，理论板数符合要求。

（2）专属性试验：取TAK06样品适量，分别用1.0mol/L 盐酸、1.0mol/L 氢氧化钠、5%双氧水、105℃高温及4500Lx 光照对其进行破环试验，试验后按照2.1 色谱条件进行检测。结果表明：色谱图中主峰与相邻杂质峰能完全分离；TAK06 主峰均能与酸、碱、氧化、高温、光照降解产物较好分离，说明本法的专属性良好。

（3）线性范围：取TAK06 对照品适量，用乙腈制成 浓 度 分 别 为10ug/ml、20ug/ml、50ug/ml、80ug/ml、100ug/ml、 120ug/ml 的溶液，各取20μl，连同空白溶剂分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度C 对TAK06主峰面积A 进行线性回归（见下图），得回归方程为：Y=131.64X-29.978，R=0.9997 结果表明，TAK06 浓度在10 ～120ug/mL 范围内线性关系良好。

（4）精密度试验：分别精密称取TAK06 样品适量，用乙腈溶解并制成含TAK06 为0.1mg/mL 的溶液，独立配制6 份，依法测定，分别考察TAK06 保留时间、主峰面积、最大单个杂质、总杂质的相对标准偏差（数据见下表2）。结果显示，TAK 主峰保留时间RSD%为0.50%，主峰面积RSD%为0.55%，最大单杂RSD%为4.05%，检测结果杂质总量RSD%为1.38%；本方法精密度符合要求。

表2：精密度试验数据

（5）检测限及定量限的确定：取TAK06 对照品适量，用乙腈制成浓度为0.1mg/mL，以乙腈为溶剂，按照逐步稀释法依次稀释，进样测定，确定TAK06 的检测限（S/N ＝3）为0.1ug/mL，确定TAK06 的定量限（S/N＝10）为0.3ug/mL。

（6）溶液稳定性试验：取2.3.4 精密度试验项下的一份溶液，分别于0,1,2,4,8h 依法测定，分别考察TAK06 主峰面积、最大单个杂质、总杂质的相对标准偏差（数据见下表3）。数据显示，主峰面积的RSD为0.25%，最大单杂RSD%为1.69%，总杂质的RSD%为1.53%。结果表明，供试品溶液在8h 内稳定。

表3 ：溶液稳定性试验数据

（7）供试品测定：取三批样品分别重复测定三次，分别考察最大单个杂质、总杂质的相对标准偏差（数据见下表4）。检测结果见下表.

表4 ：三批样品测试数据

本实验对HPLC法测定5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛（TAK06）的有关物质进行了方法学研究，并经上述方法学验证，本实验标准中最后确定依折麦布有关物质检测的色谱条件为辛基硅烷键合相硅胶为填充剂的色谱柱，流动相A 为0.1%的甲酸水溶液；流动相B 为乙腈，并进行梯度洗脱。检测波长254 nm，流速1.0 mL/min。该方法可以把工艺副反应产物、降解杂质均实现较好分离，主峰及已知杂质出峰顺序为：杂质A、杂质C、杂质B、TAK06；相对保留时间分别约为0.45、0.77、0.94和1.00；其分离度大于2.0。系统适用性、专属性、线性和范围、定量限与检测限、准确度、精密度、溶液稳定性均符合检测要求，可以有效控制产品质量。

[1] Yasuyoshi Arikawa, Haruyuki Nishida, Osamu Kurasawa, Atsushi Hasuoka, Keizo Hirase, Nobuhiro Inatomi, Yasunobu Hori, Jun Matsukawa, Akio Imanishi, Mitsuyo Kondo, Naoki Tarui, Teruki Hamada, Terufumi Takagi, Toshiyuki Takeuchi, and Masahiro Kajino.Discovery of a Novel Pyrrole Derivative 1-[5-(2-Fluorophenyl)-1-(pyridin-3-ylsulfonyl)-1H-pyrrol-3-yl]-N-methylmethanamine Fumarate (TAK-438) as a Potassium-Competitive Acid Blocker (P-CAB). J. Med. Chem., 2012, 55 (9), pp 4446菂4456