青霉菌固体发酵对三七药材活性成分的影响

青霉菌固体发酵对三七药材活性成分的影响

许文迪,闫炳雄,邱智东,王伟楠*

(长春中医药大学,长春 130117)

摘要：目的对三七药材经青霉菌发酵之后的主要活性成分变化进行研究。方法利用青霉菌对三七药材进行固体发酵，根据HPLC-Q-TOF-MS的检测结果，对三七发酵产物的主要活性成分进行分析和指认，同时考察黄曲霉素和赭曲霉素等微生物毒素的含量。结果三七药材经青霉菌发酵之后稀有皂苷含量显著提高，未见黄曲霉素和赭曲霉素产生。结论青霉菌可以对三七药材中皂苷类成分进行转化，提高稀有皂苷含量，改变药性，且未见明显的微生物毒素产生，具有一定的使用安全性。

关键词：青霉菌；三七；活性成分；液质联用

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2015.06.009

中图分类号：R284.2文献标志码：A

文章编号：2095-6258(2015)06-1123-02

基金项目：国家科技支撑计划课题(2012BAI29B05)。

作者简介：许文迪(1990-),女,硕士研究生，主要从事中药药剂学研究。

收稿日期:(2015-10-11)

*通信作者：王伟楠，博士，讲师，电话-15500072857，电子信箱-cnweinanwang@163.com

Chemical changes of bioactive compounds in Panax notoginseng fermented by Penicillium sp.

XU Wendi, YAN Bingxiong, QIU Zhidong, WANG Weinan*

(Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

Abstract:ObjectiveThe chemical changes of bioactive compounds in Panax notoginseng fermented by Penicillium sp. were studied in this paper.MethodThe major components together with aflatoxins and ochratoxins of the fermented panax notoginseng were analyzed and determined by HPLC-Q-TOF-MS. ResultThe content of rare ginsenosides in the fermented panax notoginseng significantly increased while neither aflatoxins nor ochratoxins was detected. ConclusionThe accumulation of rare ginsenosides and enhancement in efficacy of panax notoginseng could be achieved by fermenting with Penicillium sp. without any obvious biotoxins. Hence this fermentation product was either beneficial or harmless.

Keywords:Penicillium sp.; Panax notoginseng; bioactive components; LC-MS

现代药理研究[1-3]表明，三七具有活血、止血、保护心肌、降血糖、提高记忆力、滋补强壮、免疫调节等疗效。三七总皂苷(PNS)是三七的主要生理活性成分，含量达6 %[4-7]。本课题组前期发现三七药材自然贮存过程中，非常容易感染青霉。本实验首先利用青霉菌对三七药材进行发酵，然后采用LC-MS方法，对青霉菌发酵三七药材过程中，主要活性成分的变化进行检测，为指导三七药材的开发和利用以及稀有皂苷的大规模生产提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料Agilent 1260高效液相 (Agilent Technologies, USA)、Agilent 6520 Q-TOF 质谱仪(Agilent Technologies, USA)；生物安全柜(Thermo scientific 1300 A2)；恒温恒湿培养箱(金坛市天竟实验仪器厂)。 青霉菌(CICC 2515)购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，复苏后先于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上扩繁，积累到一定生物量后，4 ℃斜面保存，备用。1.2方法1.2.1三七药材固体发酵三七药材粉碎(过1号筛)，加入60 %(V/W)的蒸馏水，搅拌均匀，分装于250 mL)广口瓶中，放入高压蒸汽灭菌器中保持温度121 ℃，灭菌60 min，取出，自然冷却至室温，在生物安全柜中接种青霉菌适量，待接种完成后放入温度为28 ℃，湿度65 %恒温恒湿培养箱中，培养20 d，备用。1.2.2色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX SB-AQ (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；柱温：室温；检测波长：203 nm；进样量：10 μL。1.2.3方法学考察1.2.3.1精密度考察取同一供试品溶液，按1.2.2项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，并计算共有峰与特征峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性，计算RSD值。结果表明共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3 %，说明该方法精密度符合要求。1.2.3.2重复性考察取同一批次三七发酵产物样品6分，依1.2.1项下方法制备供试品溶液，按1.2.2项下色谱条件测定，记录色谱图，并计算共有峰与特征峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果表明共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3 %，说明该方法精密度符合要求。1.2.3.3稳定性考察取同一供试品溶液分别于制备后0、2、4、6、8、10 h按1.2.2项下色谱条件测定，记录色谱图，计算RSD值。结果表明共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3 %，说明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

2结果

2.1色谱峰归属三七药材经青霉菌固体发酵后主要活性成分发生较大变化。根据分子量和结构裂解规律，推断1-12号色谱峰均为皂苷类成分。对皂苷类成分的分子量、极性的大小及相对保留时间，进行归纳总结，将色谱峰1、2、3、6、8、9分别指认为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd和Rh4；经过标准品对照，色谱峰4、5、10、11和12分别鉴定为Rh1、F1、F2、Rg3和CK；色谱峰7的m/z= 637.4451 [M-H]-，计算分子式为C36H62O9，是人参皂苷Rh1和F1的同分异构体，根据三七及其加工产品成分分析的文献[8-9]报道，推测该化合物为Sanchinoside B1。2.2药材及发酵产物皂苷含量变化三七药材经过发酵后，原生苷R1、Rg1、Re以及Rb1的含量均有不同程度的降低，而极性较低的稀有皂苷含量均有大幅度的提高；通过液质联用的定量模式，记录不同色谱峰发酵前后的峰面积变化，结果表明：三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1经发酵后含量分别降低64.15 %、6.89 %、1.99 %、87.84 %；而人参皂苷Rd和F2分别提高161.20 %和372.35 %；同时，在青霉发酵后的三七中检出了稀有皂苷F1、Sanchinoside B1、人参皂苷Rg3和人参皂苷CK。

3小结

通过上述实验结果得出，青霉菌可以对三七药材中皂苷类成分进行转化，并提高稀有皂苷含量，使得到的发酵产物展现出较高的临床应用价值和挖掘潜力，为指导三七药材的开发和利用以及稀有皂苷的大规模生产提供理论依据。然而，利用提取离子模式(EIC)对特定分子量的黄曲霉素和赭曲霉素进行检测，并未发现明显的微生物毒素产生，推测可能是在三七药材基质上生长抑制了青霉合成微生物毒素的能力，因此，利用青霉菌发酵三七，提高活性成分含量，改造药材品质具有一定的可行性。

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