SPIO和19F探针在MRI活体示踪免疫细胞中的应用

作者单位：

河南省新乡医学院生命科学技术学院，新乡 453003

通讯作者：

冯志伟，E-mail：xxyxy_fzw@163. com

收稿日期：2014-08-06

接受日期：2014-09-26

文献标识码：A

DOI: 10.3969/j.issn.1674-8034.2015.03.015

杨海杰, 冯培, 王勉, 等. SPIO和 19F探针在MRI活体示踪免疫细胞中的应用.磁共振成像, 2015, 6(3): 230-234.

[摘要] 日益成熟的体内成像技术，结合不断完善的细胞疗法，推动了体内免疫细胞示踪研究领域的一场变革。随着SPIO探针和 19F探针的不断改进，MRI技术的应用范围得以拓展，如借助成像指导的免疫细胞的输送，免疫细胞回归和移植的可视化，以及对炎症和免疫细胞生理变化的监测等。以MRI技术为基础的细胞示踪技术，已被广泛用于示踪活体免疫细胞的去向或评估免疫细胞的疗效。作者着重对SPIO和 19F探针在MRI示踪活体免疫细胞的最新进展做一综述。[关键词] 免疫细胞；磁共振成像；造影剂

Application of SPIO and 19F probes in magnetic resonance imaging to track in vivo immune cells

YANG Hai-jie, FENG Pei, WANG Mian, FENG Zhi-wei *

Xinxiang Medical University, Henan Province, Xinxiang 453003, China

*Correspondence to: Feng ZW, E-mail: xxyxy_fzw@163.com

Received 6 Aug 2014, Accepted 26 Sep 2014

Abstract The increasing confinement of in vivo imaging technologies, combined with the development of emerging cell therapies, has led a revolution in the field of immune cell tracking in vivo. With the rapid improvement of SPIO- and 19F-based probes, range of magnetic resonance imaging (MRI) application is broadened. For example, MRI technologies have been introduced to image-guided immune cell delivery, and he visualization of immune cell homing and implantation, inflammation, and cell physiology. MRI-based cell tracking technologies have been widely used to follow the fate of immune cells in vivo, or evaluate the effect of cell therapy in vivo. This review focuses on the application of SPIO and 19F probes in magnetic resonance imaging to track in vivo immune cells.

Key words Immune cells; Magnetic resonance imaging; Contrast media

MRI技术在成像仪以及人和动物体内特异性分子可视化领域的迅速发展，使得无毒标记探针的应用成为可能 [1-3]。MRI的优点是：它不使用电离辐射，因此可以安全地对较深的内部组织进行高清晰成像。MRI技术不仅可以使活体内细胞的数量和位置可视化，还可以使更复杂的生物过程可视化，如对免疫细胞的生物学活性及其激活程度的可视化。这一技术所用的外源性细胞标记物是用氧化铁纳米颗粒或全氟化碳(perfluorocarbon，PFC)纳米乳剂制成的 [4-5]。笔者着重就MRI技术在免疫细胞体内示踪方面的应用做一综述。

1　MRI信号分类

MRI的信号主要来自于可移动的水质子(如 1H)或氟化分子(如 19F) [1]。当研究对象被放置在一个大的静态磁场中时， 1H或 19F的原子核会产生沿着磁场方向排列的磁矩。而 1H或 19F的原子核会受到脉冲射频辐射的干扰，因此可以通过移除射频辐射使原子核恢复平衡，这样就在接收机天线上产生了一个构成核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)信号的瞬变电压。特定条件下的物理特征，如原子核的密度、原子核自旋-晶格弛豫时间(T1)和自旋-自旋弛豫时间(T2)，都可用做NMR信号定量的指标。原子核沿着磁场方向排列是在弛豫时间T1内逐渐发生的。T2则反映了NMR信号的持续时间。MRI信号可以通过以下四种方式进行控制：(1)含顺磁性金属的阳性对比剂(如Gd 3+)；(2)诱导化学交换饱和转移的分子探针(如酰胺质子)；(3)含超顺磁氧化铁的阴性对比剂；(4)含 19F的分子探针 [1]。在此对前景最好的后两种探针的示踪原理做一简单介绍。

1.1 含超顺磁氧化铁的阴性对比剂

超顺磁氧化铁(superparamagnetic iron oxide，SPIO)对比剂主要通过氧化铁晶体的强磁性来影响T2。这种试剂通常由葡聚糖覆盖的二价铁和三氧化二铁(FeO-Fe 2O 3)的小晶体颗粒构成，通过对附近磁场的强烈干扰使它们周围的水分子形成不均匀的磁场，从而降低MRI信号的强度(阴性造影) [4]。

1.2 含 19F的分子探针

19FMRI和 1H的检测与成像的物理原理相同。以 19F作为示踪剂的 19F MRI可以直接检测到携有 19F原子核标记的细胞。 19F的信号强度与氟原子数以及用于标记的细胞数目是成正比的。通常用 1H和 19F共同作标记得到的复合图像，可以显示解剖环境中含有标记细胞的区域 [5]。

2　SPIO探针在免疫细胞示踪中的应用

2.1 SPIO探针示踪免疫细胞的原理

在检测细胞数量时，用顺磁性金属离子(如Gd 3+)作为标记信号的灵敏度不够高。而SPIO纳米颗粒则很好地克服了这一不足。某些特殊的金属离子，例如SPIO中的铁离子，在磁场中的协同趋向会对局部磁场形成较强的干扰，在干扰区域周围的水质子会产生一个强的阴性造影，使得含SPIO纳米颗粒区域的图像变得更深。用SPIO纳米颗粒标记免疫细胞主要有两种方法：对于分选后的或混合的细胞群，可在体外培养时，在培养基中直接用SPIO纳米颗粒对细胞进行标记；对于未经分选的吞噬细胞种群(如巨噬细胞)，可以通过静脉注射SPIO纳米颗粒进行原位标记。实际应用中，人们常把荧光染料耦合到SPIO颗粒上以形成双模式试剂，并借助光镜活检来实现对MRI细胞的追踪 [6]。

2.2 SPIO探针体外标记免疫细胞

人们最初用SPIO探针体外标记淋巴细胞。先用来标记淋巴细胞的细胞膜，随后用来标记淋巴细胞的内体结构。细胞膜标记是通过将特异性抗体或多肽引入到特定的细胞表面抗原(表位)来实现的。对那些吞噬能力或胞饮能力弱的免疫细胞，则需要具透膜能力的多肽或转染试剂的辅助，来实现胞内标记的目的。SPIO胞外标记淋巴细胞难度较大，是因为它的非活化细胞的胞质体积较小且吞噬能力弱。目前使用最多的SPIO免疫细胞标记方法是：先把带负电荷的SPIO颗粒与各种阳离子转染剂(如聚-L-赖氨酸、精蛋白)制备成复合物，然后将复合物和细胞一起进行体外培养 [7]。Ahrens等 [8]将SPIO和CD11c抗体混合后，对树突状细胞(dendritic cells，DC)进行体外标记，发现CD11c受体可介导DC细胞对SPIO纳米颗粒的内吞。该研究表明利用受体介导的内吞作用可有效对免疫细胞进行SPIO标记，再进行MRI活体示踪分析。此外，Walczak等 [9]利用电穿孔技术亦有效地将SPIO纳米颗粒标记到了淋巴细胞上，并进行了MRI示踪分析。

2.3 SPIO探针在免疫细胞活体示踪中的应用

基于MRI的SPIO纳米颗粒已广泛应用于早期临床研究中对免疫细胞的示踪，包括细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞向肿瘤组织的回归、自身免疫性T淋巴细胞的器官特异性回归及癌症疫苗中DC细胞迁移模式的研究 [10]。这些研究实践表明，微米级的氧化铁颗粒在淋巴细胞胞外标记中的灵敏度高于纳米级的SPIO颗粒。由于微米级的氧化铁颗粒半径比SPIO颗粒大10倍，因此被标记的细胞磁性更大 [11]，因而可现实单细胞水平的检测。但是这些微米级颗粒用于临床研究的前景并不被看好，这是因为用高性能MR仪对SPIO纳米颗粒标记的巨噬细胞进行扫描时，亦可以实现单细胞水平的成像。

标记后免疫细胞表型的变化会降低免疫治疗的效果，因此任何用于成像的细胞标记方法都应该避免从本质上改变细胞的免疫学特性，且不能有明显的细胞毒性或引发细胞表型和功能发生变化。但SPIO生物相容性好，易发生生物降解，在某些类型细胞中可被快速降解，因此非常适合短期成像的研究。例如，SPIO颗粒可被肝脏中的枯否细胞吸收，给药一周后铁的代谢产物便会在血红蛋白中出现 [1]。另一项研究亦显示，SPIO标记的DC细胞在细胞因子种类、细胞表面标记物、迁移能力和抗原呈递能力上与未标记的对照细胞并无差别 [12]。

活体细胞标记是通过体内注射SPIO纳米颗粒后，颗粒被网状内皮系统(reticuloendothelial system，RES)中的巨噬细胞吸收来实现的。RES主要包括血液循环中的单核细胞和组织中的巨噬细胞，它们通常在炎症发生时聚集。在早期临床和临床实践中，该技术已普遍应用于炎症性病变的成像 [13]，如对肿瘤淋巴结的成像和动脉粥样硬化斑块的测定 [14]。把SPIO复合物直接注射到组织中也可以实现对免疫细胞的原位标记。在对小鼠的研究中，小鼠接种放射标记的肿瘤细胞后，SPIO对DC细胞的标记可以通过DC细胞对抗原和SPIO的共同捕获来实现。在接种所谓的“磁化疫苗”数天后，就可以观察到标记的DC细胞回归到前哨淋巴结(sentinel lymph node)。

2.4 SPIO探针应用于免疫细胞示踪的局限性

以SPIO纳米颗粒为基础的细胞示踪也有局限性。如：(1)如处于有丝分裂期的细胞，细胞内标记信号会随着细胞分裂而被逐步稀释，因此很难对细胞进行长期观察。(2)死亡细胞可导致铁试剂的扩散，并最终导致失去MRI检测信号。(3)对比剂会转移到组织自身内的吞噬细胞(如巨噬细胞)中，当标记的吞噬细胞在同一个目标区域大量聚集时，可能造成假阳性。需要指出的是，这些局限性也是所有以纳米颗粒和PFC纳米乳剂为基础的成像试剂所共有的。

3　19F探针在免疫细胞示踪中的应用

3.1 19F探针示踪免疫细胞的原理

PFC乳液和SPIO纳米颗粒一样可以用于体外细胞示踪和原位细胞标记。以PFC为基础的细胞示踪可以实现高特异性的细胞检测和细胞定量。PFC标记细胞后用 19F MRI检测，而SPIO纳米颗粒标记细胞后用 1H MRI检测。PFC作为示踪剂而不是对比剂的原因是 19F MRI可以直接检测到标记细胞的 19F原子核。更重要的是，由于人体内天然的 19F含量很低， 19F MRI在实验对象组织中几乎没有背景信号。因此只有被标记的细胞可以被观察到，从而克服了以金属离子为基础的细胞标记时假阳性高的缺陷。除此， 19F MRI信号强度与目标区域中被标记的细胞数量或者炎症的严重程度直接相关。

PFC类是现有人工合成的生物惰性最强的有机分子 [5-6，15]。它们不溶于水，和细胞膜不相容，使用时必须配制成胶体悬浮液，如纳米乳液，直径小于200 nm是最理想的尺寸 [16]。由于在体内没有已知的酶类可以代谢PFC，且PFC也不会在溶酶体的酸度范围被降解，因此PFC适用于长期的显像研究。

3.2 19F探针体外标记免疫细胞

PFC作为 19F MRI示踪剂在免疫细胞追踪领域中的应用近几年才得以发展。对于体外标记来说，纳米乳剂的配方颇具创新性。因为标记细胞时不需要转染，所以细胞的活力和PFC的易用性大为提高。已有研究用小鼠DC细胞和T细胞 [17]就PFC对原代免疫细胞的表型及功能的影响进行了评价。在一项迄今为止关于PFC标记对人原代DC细胞影响最为全面的研究中，细胞活力、表型、细胞因子的分泌、T细胞的刺激能力和趋化能力等多个检测指标均被涵盖 [18]，其结果显示PFC体外标记对DC细胞主要特性并无显著影响。3.3 19F探针在免疫细胞活体示踪中的应用

PFC活体细胞示踪最早被用于观察小鼠体内DC细胞的转移。以PFC为基础的T细胞示踪技术已用于多种疾病的动物模型，如非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠的早期胰腺炎症，以及炎症性肠道疾病(IBD) [19]。在IBD疾病的研究中意外地发现，黏蛋白1(MUC1)特异性T细胞定位于胰管中，提示胰腺炎事实上可能是IBD的肠道外表现。此外，在一项关于人原代DC细胞免疫治疗的临床试验中，PFC标记人DC细胞后接种到NOD-重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内，18 h内即可观察到标记的成熟DC细胞定向迁移至引流(draining)淋巴结 [18]。

对聚集到炎症部位的巨噬细胞的成像有助于了解宿主的炎症反应，这对多种疾病都有很高的诊断价值，甚至还可以作为替代标记来监测治疗的干预效果。在血液中有较长半衰期的纳米乳液配制后用于静脉注射，乳液进入RES后，大量液滴被单核细胞和巨噬细胞原位吸收，少量的由中性粒细胞和DC细胞吸收。原位标记的细胞参与了体内炎症反应，导致 19F在炎症部位的聚集。更重要的是，体内 19F MRI信号可在炎症部位进行量化，因此 19F的信号强度可直接反映巨噬细胞的数目。 19F原位标记细胞技术已广泛用于人类疾病在早期临床中炎症的可视化，如IBD [19]、细菌感染 [20]、器官移植排斥反应 [21]、实验性变态反应性脑脊髓炎、外周神经的炎症 [22]、肺部炎症 [23]和心脏炎症脑缺血等 [24]。

3.4 19F探针和荧光探针的联用

与双模化的SPIO试剂类似，PFC纳米乳液也可以设计成 19F MRI和荧光试剂双信号检测系统。PFC在乳化前先和荧光染料结合，以实现 19F MRI信号和荧光信号对免疫细胞的同步标记。荧光基团使人们可借助流式细胞仪、荧光显微镜或体内光学成像等技术来确定被标记细胞的表型和定位。双模化PFC乳剂已被用于标记小鼠原代CD4 +T细胞。T细胞被移植到野生型小鼠体内后，可借助MRI对野生型小鼠淋巴结进行成像，并运用光学成像技术进一步分析外源CD4 +T细胞的分布和定位。近红外染料也可被整合入PFC乳液，用于较浅部位组织的成像。此外，由于荧光PFC乳剂具有亮度高、毒性低以及在细胞中保留时间长等优点，将其作为单一的光学探针来标记细胞亦具有不错的应用前景。

3.5 19F探针与NMR技术的联用

在固定后的、完整的组织中，传统的 19F NMR的光谱亦可用于测定PFC标记的免疫细胞的生物分布，且具有高灵敏性。此外， 19F NMR还可用来测量组织样本中标记的细胞总数或细胞密度。有人在IBD和糖尿病的啮齿动物模型中，用NMR细胞计量法测定了人外源T细胞的生物分布 [18]。由于NMR是非破坏性的，因此组织样本随后还可以进行组织学处理以便获得更多的数据。NMR仪器也可用于完整离体组织样本的炎症指数的快速、定量分析，所得到的炎症指数和巨噬细胞的数目与NMR信号是成正比的。功能性 19F NMR光谱仪是实验室较常见的用于分子结构测定的仪器，将NMR细胞仪的应用拓展至PFC标记免疫细胞的检测非常值得期待。

4　MRI技术的转化前景与挑战

但是，基于SPIO的MRI细胞示踪技术在临床上的应用仍不够成熟 [25]。其首次临床试验是将SPIO纳米颗粒体外标记的DC细胞疫苗用于免疫治疗，借助超声成像把这些细胞引导和输送至黑色素瘤患者的腹股沟淋巴结。但MRI检测结果显示8位患者的目标淋巴结中仅有4位检测到信号。另一研究中，SPIO颗粒体外标记的外周血单核细胞经系统注射后，可以在皮肤的炎症部位检测到明显信号 [26]。遗憾的是，由于经济上的原因，用于细胞标记的商品化SPIO试剂—菲立磁注射液(Feridex)和铁羧葡胺已出现停产 [1]。

与SPIO标记技术相比，PFC纳米乳剂标记技术在MRI细胞追踪领域受到更多的重视。PFC在临床上的发展更具优势：其探针毒性低、易获得高特异性的图像、可对活体内细胞数目进行定量分析。与SPIO试剂相比，PFC检测灵敏度虽低，却可被 19F成像没有背景信号干扰所弥补。 19F MRI临床扫描仪在实际操作和定量上的技术障碍也是可以克服的，因为目前已有研究利用 19F MRI技术收集到了可靠、有效的数据 [1，27]。

总之，无论是针对基础免疫学，还是指导实验性免疫细胞的治疗，基于MRI的细胞追踪技术均具有很大的发展空间。未来，基于MRI的细胞示踪也许会被用于常规的临床实验，或用于疗效监控，如对细胞输送情况和炎症程度的监控。同时，MRI扫描仪软件自动化进程的加快，将会大大提高人们对图像的解读和分析能力。此外，可否将SPIO和PFC细胞标记技术联合使用，以进一步发挥各自优势？随着更多新的MRI示踪技术的不断涌现，人们可以更快速、有效地对体内各种生理活动进行实时观察。