弱化F1F0-ATP酶植物乳杆菌的突变分析及其作为益生添加物在四川泡菜中的应用探索

宋菲菲，林 凯，蔡 婷，徐顾榕，袁春红，张 庆，向文良

(西华大学食品与生物工程学院，四川省食品生物技术重点实验室，西华大学古法发酵(酿造)生物技术研究所，四川 成都 610039)

·生物工程·

弱化F1F0-ATP酶植物乳杆菌的突变分析及其作为益生添加物在四川泡菜中的应用探索

宋菲菲，林 凯，蔡 婷，徐顾榕，袁春红，张 庆，向文良*

(西华大学食品与生物工程学院，四川省食品生物技术重点实验室，西华大学古法发酵(酿造)生物技术研究所，四川 成都 610039)

从退化的植物乳杆菌中筛选到弱化F1F0-ATP酶突变株LPS08、LPS21和LPS24。在LPS08的F1F0-ATP酶β亚基中，Phe-91、Ser-380和Leu-436分别被Leu、Pro和Pro替换，导致F1F0-ATP酶的活性降低了5.61%；LPS21中，Leu-268突变改变了β亚基的构像，导致F1F0-ATP酶活性降低43.44%；LPS24中Asn-205、Ser-380和Pro-419分别被Ser、Leu和Leu所取代，降低F1F0-ATP酶活性19.46%。LPS08、LPS21和LPS24分别接入初始pH6.5的MRS液体培养基中37 ℃培养72 h后，pH值分别为3.73、3.82和4.25，酸度(乳酸计)分别为2.0、1.56和0.95 g/100mL。按106CFU/mL盐卤量分别将3株突变株接入pH4.6的无菌泡菜中，30 °C孵育7 d后，仅有LPS21的泡菜盐卤pH维持在4.2以上，满足四川泡菜对酸味口感的要求。同时，盐卤中LPS21菌体的含量(7.27 log CFU/mL)满足国际上益生菌食品中关于活菌量的要求。因此，弱化F1F0-ATP酶LPS21突变株作为益生添加物添加到泡菜中生产益生菌泡菜时，能够从根本上解决益生菌泡菜在常温下贮存、运输和销售过程中的后酸化问题。

植物乳杆菌；F1F0-ATP酶；突变分析；益生添加物；四川泡菜

四川泡菜作为中国泡菜的典型代表，以其独特的风味享誉国内外。近年来，随着我国泡菜产业的高速发展和人们泡菜消费量的急剧增加，富含乳酸的传统益生泡菜由于货架期短，销售区域狭窄，已不能满足行业发展的要求；因而，国内绝大多数泡菜企业开始生产灭菌泡菜。灭菌泡菜产品中不含活的乳酸菌，延长了产品货架期、拓展了销售区域，但也因此失去了乳酸菌带来的益生功能。将益生菌作为益生添加物添加到食品中是目前国际上生产非奶益生食品的重要方法[1-2]。为了弥补泡菜因灭菌而失去的益生功能，国内部分企业也开始尝试向灭菌后的泡菜中添加乳酸菌；但是，这些企业为了节约成本，对添加了益生菌的泡菜产品往往不愿意采用冷链贮存、运输和销售，因此产品常常出现后酸化。后酸化是制约灭菌泡菜添加益生菌以生产益生菌泡菜的关键难题。那么，能否寻找到一种既能在灭菌泡菜中正常繁殖，又防治后酸化的乳酸菌作为益生添加物呢？

植物乳杆菌是泡菜发酵中后期的优势菌种[3-4]，也是非奶益生食品常选用的益生添加物[1-2]。植物乳杆菌具有较强的产酸能力和耐酸性[5]，当外界环境的pH值降低时，植物乳杆菌质膜上的F1F0-ATP酶通过水解ATP提供能量将细胞内的H+泵出胞外，维持胞内pH接近中性，胞内代谢不受影响，从而能够在低pH值环境中继续生长和产酸。这是导致灭菌泡菜添加植物乳杆菌后在常温下贮存、运输和销售发生后酸化的主要原因。F1F0-ATPase是一种跨膜蛋白酶复合物，由胞外的F1和嵌入细胞膜的F02部分构成[6]。其中，F1由α、β、γ、δ和ε 5种亚基构成。所有乳酸菌中都含有F1F0-ATP酶，它不仅可以调控乳酸菌胞内的pH，还可以增强细胞的耐酸性[7-8]，促进能量ATP转化。Jaichumjai等[9]研究表明：低活性的F1F0-ATP酶变异株对酸性环境非常敏感，当外界环境pH值降到一定程度时，细胞内H+的泵出效率降低，代谢受到影响，产酸能力下降。因此，选用低活性F1F0-ATP酶的植物乳杆菌突变菌株作为益生添加物，成为了灭菌泡菜添加乳酸菌后防治在常温下贮存、运输和销售环节发生后酸化的有效方法。

基于此，我们以产酸退化的植物乳杆菌为研究对象，筛选弱化F1F0-ATP酶突变株，分析F1F0-ATP酶β亚基的突变以及突变对F1F0-ATP酶活性的影响，评估无菌四川泡菜中添加弱化F1F0-ATP酶植物乳杆菌后的后酸化和菌体生长繁殖情况，为四川泡菜筛选益生添加物提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

产酸退化的植物乳杆菌和出发菌株CCTCC 207202，由四川高福记生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 弱化F1F0-ATP酶植物乳杆菌的筛选

100 μL产酸退化植物乳杆菌活化后的悬液分别涂布于含有0 和500 μg/mL新霉素的MRS固体培养基平板上， 37 ℃培养2～3 d，挑选微小的菌落做后续分析。

1.2.2 弱化F1F0-ATP酶植物乳杆菌的生长特性分析

过夜培养的菌体接种到不同初始pH值的MRS液体培养基中，37 ℃静止培养，560 nm测定不同培养时间菌悬液的OD值，pH计测定培养液pH值。培养液中可滴定酸度以乳酸计，依据AOAC 2000方法进行。

1.2.3 F1F0-ATP酶的β亚基编码序列的扩增及突变分析

采用CTAB-SDS方法[10]分别提取突变株与出发株CCTCC 207202的总DNA，PCR扩增F1F0-ATP酶 的β亚基部分编码碱基序列。扩增引物atpDf：5′-GTT GGT AAR ACY GTT TTA ATT- 3′；atpDr：5′-TCT TCR GAY AAT TCA TC- 3′[11]。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸5 min，35个循环后72 ℃延伸10 min。PCR产物连接到pGM-T载体上，克隆入感受态E.coliDH5α，提取重组质粒DNA，测序。比较所得序列编码的氨基酸，探寻突变点。

1.2.4 F1F0-ATP酶活性分析

参见Nannen和Hutkins关于乳酸菌F1F0-ATP酶活性的测试方法[12]，分析弱化F1F0-ATPase植物乳杆菌的ATP酶活性。MRS培养基中，37 ℃静置培养突变株18 h，4 ℃条件下8 000g离心2 min收集菌体，1.0 mM MgCl2溶液洗涤2次。菌体沉淀立即重悬在0.5 M、pH 4.6、2 mM MgCl2的双甘氨肽氢氧化钾缓冲液中，添加溶菌酶至1 mg/mL后37 ℃，80 r/min孵育2 h后4 ℃条件下，10 000g离心10 min。沉淀重悬在含10 μg/mLDNA酶的1 mmd/L MgCl2溶液中，37 ℃、80 r/min孵育30 min。4 ℃、5 000g离心5 min除去未裂解的菌体细胞，4 ℃、12 000g离心10 min收集细胞膜，1 mmd/L MgCl2溶液洗涤细胞膜2次后并重悬在1mmd/L MgCl2溶液中。利用比色法测定F1F0-ATP酶催化的ATP释放无机磷酸(Pi)的量来判定F1F0-ATP酶的活性[12]。

1.2.5 弱化F1F0-ATP酶菌株对四川泡菜的酸化评估

分别将植物乳杆菌CCTCC 207202和突变株接种到100 mL的MRS液体培养基中，37 ℃静置培养15 h后，4 000g离心5 min收集菌体。 菌体沉淀用无菌生理盐水重悬后加入无菌泡菜产品中，添加106CFU/mL的盐卤。添加菌体后的泡菜产品在30 ℃环境中放置7 d，以泡菜盐卤pH值的变化评估泡菜的后酸化程度。

2 结果与讨论

2.1 弱化F1F0-ATP酶突变株的筛选

利用新霉素作为筛选压力，从产酸退化的植物乳杆菌中筛选弱化F1F0-ATPase菌株，结果如图1所示。500 μg/mL的新霉素MRS平板(图1(A))上的菌落数明显少于0 μg/mL新霉素的对照MRS平板(图1(B))上的菌落。这一结果表明：植物乳杆菌CCTCC 207202在生产或者保藏的过程中，由于某些不利因素导致某些菌株已经发生了产酸性能的退化。挑选图1(A)的MRS平板上生长较好的菌落进一步纯化后得到编号为LPS08、LPS21和LPS24纯菌株作后续分析。

图1 植物乳杆菌在500μg/mL(A)和0μg/mL(B)的新霉素MRS平板上的菌落分布

2.2 F1F0-ATP酶突变株的表型分析

在初始pH值6.5的MRS液体培养基中发现：植物乳杆菌CCTCC 207202和突变株LPS08培养12 h进入对数生长期，然而突变株LPS21和LPS24进入对数生长期则分别需要培养16 h和14 h；但是进入稳定期后，LPS21和LPS24的菌体密度与CCTCC 207202和LPS08的菌体密度相差不大，皆在OD560nm2.25～2.45之间。在整个培养过程中，LPS21和LPS24的产酸量明显低于CCTCC 207202和LPS08的产酸量(图2)。72 h后，CCTCC 207202和LPS08产酸量约为2.0 g/100 mL, LPS21和LPS24则分别为1.56 g/100 mL和0.95 g/100 mL。培养过程中，突变株与出发株的培养液pH值变化也表现出了与产酸类似的趋势 (图2)。培养8 h时，3株突变株MRS培养液的pH值皆高于出发株CCTCC 207202的pH值，然而当培养到72 h后，仅有LPS21培养液的pH值维持在泡菜酸味的临界值4.2以上(pH<4.2,泡菜过酸)，表明了LPS21对酸极为敏感。因此，突变株LPS21作为灭菌泡菜的益生添加物时，是一株极有可能阻止四川泡菜后酸化的优良候选菌株。

图2 接种植物乳杆菌CCTCC 207202和其突变株的MRS液体培养基的pH值和酸度变化(■和□、◆和◇、▲和△、●和○分别指示CCTCC 207202和突变株LPS08、LPS21和LPS24，实心和空心图示分别代表pH值和酸度)

2.3 F1F0-ATP酶的活性分析

为了进一步调查突变株酸敏感性的原因，分析3株突变株和出发株的F1F0-ATP酶在pH4.6(与泡菜产品pH一致)条件下的活性，结果如表1所示。与出发株CCTCC 207202相比较，LPS08菌株的F1F0-ATP酶的活性仅下降了5.61%，然而，LPS21和LPS24的F1F0-ATP酶的活性则分别下降了43.44%和19.46%。Vol Ballmoos等[7]认为微生物细胞内H+平衡的调控主要依靠细胞膜F1F0-ATP酶催化ATP获得能量进行调节；因此，3株突变株的F1F0-ATP酶活性的差异表明了它们在H+跨膜运输能量代谢方面的不同，从而造成了细胞内H+的平衡失调程度不同，因而菌体在生长速率、产酸方面存在着差异。同时，也暗示着突变发生在F1F0-ATP酶β亚基的不同位点。

注：“*”和“**”表示显著性差异(*P<0.05, **P<0.01;n= 3)。

2.4 F1F0-ATP酶β亚基的突变分析

PCR分别扩增发株CCTCC207202和突变株LPS08、LPS21和LPS24的F1F0-ATP酶β亚基的编码序列(GenBanK接收号：KC592155、KC592156、KC592157和KC592158)，编码序列编码的氨基酸序列利用ClustalX1.8对齐，结果如图3所示。与CCTCC 207202相比，突变株F1F0-ATP酶β亚基上某些位点的氨基酸已经发生了突变。其中，在LPS08菌株的F1F0-ATP酶β亚基上，Phe-91、Ser-380和Leu-436分别被Leu、Pro和Pro替换；但是由于这些突变位于F1F0-ATP酶β亚基的保守域外，因此并没有显著影响LPS08菌株的F1F0-ATP酶的活性。然而，在突变株LPS21中， Leu-268突变位于F1F0-ATP酶的β亚基与α亚基相互作用的区域上，其突变容易改变β亚基的构像(图4)。“构象变化假说”认为：F1F0-ATP酶的β亚基构象的改变是影响酶活性的主要因素[13- 14]；因此，尽管LPS21只有一个突变，但对F1F0-ATP酶的活性影响极大。与LPSM21相比，在LPS24的F1F0-ATP酶的β亚基中，Asn-205、Ser-380和Pro-419分别被Ser、Leu和Leu所取代；但是，由于仅有Ser-205突变位于临近F1F0-ATP酶的β亚基和α亚基的相互作区域，而其他突变没有发生在ATP接合位点、模体或与α亚基的相互作用区域，因此LPS24的突变并没有引起F1F0-ATP酶活性太大的变化。F1F0-ATP酶β亚基的突变揭示了3株突变株的F1F0-ATP酶活性存在差异的内在本质。

图3 植物乳杆菌CCTCC 207202和突变株LPS08、LPS21和LPS24的F1F0-ATP酶β亚基氨基酸突变区域的序列比对(*表示突变位点)

图4 植物乳杆菌CCTCC 207202(A)和突变株LPS21(B)F1F0-ATP酶β亚基的茎环构像(氨基酸260～280)

2.5 F1F0-ATP酶突变株在阻止四川泡菜中的后酸化时所起的作用分析

为了进一步了解弱化F1F0-ATP酶突变株作为益生添加物时能否阻止四川泡菜的后酸化，将3株突变株和出发株分别按106CFU/mL盐卤的标准接入到pH值约为4.6的无菌四川泡菜中，30 ℃放置7 d，测定泡菜盐卤的pH值，结果如表2所示。与没有添加植物乳杆菌的空白组相比，添加有CCTCC 207202、LPS08 和LPS24菌株的泡菜盐卤pH值在30 ℃孵育7 d后下降明显。相反，添加LPS21的泡菜盐卤pH值仅下降了0.3个单位，仍然维持在pH 4.2以上(表2)。所有菌体添加物均能在泡菜中生长繁殖，孵育7 d后，添加了CCTCC 207202、LPS08和 LPS24的泡菜盐卤中菌体含量分别达到8.74、8.56和8.05 log CFU/mL。尽管LPS21在四川泡菜产品中繁殖速度不及其他株菌，但孵育7 d后其产品中菌体的含量满足了国际上关于益生菌食品中的菌体含量标准(> 7.0 log CFU/mL)[15]，达到了7.27 log CFU/mL盐卤； 因此，LPS21不仅可以作为益生添加物添加到四川泡菜中，而且与添加其他菌株的泡菜相比，LPS21还可以阻止四川泡菜在常温条件下储藏、运输和销售过程中的后酸化。

3 结论

硫酸新霉素能够与细菌的30S核糖体亚基结合，抑制细菌蛋白质的合成，从而影响菌体的生长。新霉素的摄入是一个耗能过程，低活性的F1F0-ATP酶突变株不能产生足够的能量;因此不受新霉素抗性的影响，可以利用这一特性筛选出低活性的F1F0-ATP酶突变株[9]。本研究利用新霉素为筛选压力，从退化的植物乳杆菌中分别筛选到了弱化F1F0-ATP酶的突变株LPS08、LPS21和LPS24。

与出发菌株CCTCC 207202相比，LPS08、LPS21和LPS24的F1F0-ATP酶β亚基的氨基酸序列上发生了不同位点的突变。其中，LPS08的F1F0-ATP酶β亚基上的Phe-91、Ser-380和Leu-436分别被Leu、 Pro和Pro替换；但是这些突变位于F1F0-ATP酶β亚基的保守域之外，因此并没有显著影响F1F0-ATP酶的活性，仅下降了5.61%。在LPS21中，Leu-268突变位于F1F0-ATP酶的β亚基和α亚基相互作用的区域内，该突变改变了β亚基的构像，引起了F1F0-ATP酶活性的显著下降，达到了43.44%。在LPS24的F1F0-ATP酶β亚基中，Asn-205、Ser-380和Pro-419分别被Ser、Leu和Leu所取代，由于仅有Ser-205突变位于临近F1F0-ATP酶的β亚基和α亚基的相互作区域，而其他突变没有发生在ATP接合位点、模体以及与α亚基的相互作用区域;因此，LPS24的突变仅导致F1F0-ATP酶活性下降19.46%。

在初始pH6.5的MRS液体培养基中培养72 h后，LPS08、LPS21和LPS24的产酸量分别为2.0、1.56和0.95 g/100mL，培养液的pH值分别为3.73、3.82和4.25。当3株突变株作为益生添加物按106CFU/mL盐卤的量接入无菌泡菜产品中，30 ℃孵育7 d后，仅有LPS21泡菜盐卤的pH仍然维持在pH 4.2以上，满足四川泡菜对酸味口感要求；同时，LPS21泡菜盐卤中菌体的含量符合国际上关于益生菌食品中的菌体含量标准(>7.0 log CFU/mL)，达到了7.27 log CFU/mL：因此，弱化F1F0-ATP酶LPS21突变株作为益生添加物添加到泡菜中生产益生菌泡菜时，能够从根本上解决益生菌泡菜在常温下贮存、运输和销售过程中的后酸化问题。该研究为开发富含乳酸菌的益生泡菜提供了新的思路，对推动四川泡菜产业发展具有一定的积极意义。

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(编校：叶超)

Reduced F1F0-ATPase Mutation Analysis of Lactobacillus Plantarum and Its Application in Sichuan Pickle as Probiotics Adjunct

SONG Fei-fei，LIN Kai，CAI Ting，XU Gu-rong， YUAN Chun-hong，ZHANG Qing，XIANG Wen-liang*

(ProvincialKeyLaboratoryofFoodBiotechnologyofSichuan,SchoolofFoodandBioengineering,

InstituteofTraditionalBrewingTechnology,XihuaUniversity,Chengdu610039China)

Three mutation strainsL.plantarumLPS08, LPS21 and LPS24 with reduced F1F0-ATPase activity were screened from acid production degenerationL.plantarumCCTCC 207202. In F1F0-ATPaseβ-subunit of LPS08, Phe-91, Ser-380 and Leu-436 were replaced by Leu, Pro and Pro, respectively. But these mutations do not markedly affect F1F0-ATPase activity, only lead to reduction of activity of 5.61%. In mutant strain LPS21, Leu-268 mutation has changed the F1F0-ATPase β-subunit, and thus it triggered a great change with 43.44% F1F0-ATPase activity reduction. In LPS24, the Asn-205, Ser-380 and Pro-419 were respectively replaced by Ser, Leu and Leu. For these mutations, F1F0-ATPase activity decreased 19.46% . In initial pH 6.5 MRS liquid medium, the pH values respectively mediated by mutation strain LPS08, LPS21 and LPS24 were 3.73, 3.68 and 4.25, and their acidities were 2.0 g/100 ml, 1.56 g/100 ml and 0.95g/100 ml after cultured at 37 °C for 72h. Compared with parent strain CCTCC 207202, only the mutation strain LPS21 could overcome post-acidification when their cultures were incorporated into aseptic Sichuan pickle products at 6 log CFU/ml salt brine level and kept at 30 °C up to 7 days, and its viable count in products(7.27 log CFU/ml) also satisfied the criteria for a probiotic food product. Therefore, the F1F0-ATPase mutant strain LPS21 is attractive as probiotics cultures adjunct in Sichuan pickle products to prevent post-acidification during the product handing, transportation and storage at ambient temperature.

L.plantarum; F1F0-ATPase; mutant analysis; probiotics adjunct; Sichuan pickle

2014-09-18

教育部春晖项目(Z2014061)；四川省应用基础项目(2014JY0045)；四川省教育厅重点项目(14ZA0110)；四川省食品生物技术重点实验室项目(SZJJ2014-007)

TS201.3

A

1673-159X(2015)05-0097-06

10.3969/j.issn.1673-159X.2015.05.018

*通信作者：向文良(1973—)，男，副教授，博士，主要研究方向为中国西南地区特色发酵食品微生物分子生态与生物过程学。E-mail：biounicom@mail.xhu.edu.cn