SPIO纳米颗粒在肝癌磁共振早期诊断的基础研究进展

陈柱，肖恩华

中南大学湘雅二医院放射科，长沙410011

原发性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)是指肝细胞或肝内胆管上皮细胞发生的恶性肿瘤，80%～90%为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)，本文中讨论的肝癌即为肝细胞癌。肝癌是严重危害人们身体健康的主要的恶性肿瘤之一，具有病死率高以及预后差的特点，居世界癌症死亡原因的第3位，仅次于肺癌和胃癌，每年约有60万～70万人死于肝癌，其中约一半发生在中国。在我国肝癌的病死率位居第2位，仅次于胃癌，并且大多数肝癌起病隐蔽，往往缺乏明显特征性的症状或体征，患者就诊时大多已属中晚期或进展期[1-2]。很大一部分患者发现肝癌后就已经失去了最佳的治疗时机，如果能够及时发现肝癌，患者的治疗效果将会得到大大改善，因此如何早期发现和早期诊断肝癌非常重要，是肝癌诊疗领域中的重要课题之一。已有研究表明，磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)能够准确地对肝癌进行显示，能够发现一些其他检查手段例如CT不能发现的病变，但是对于发现比较小的病灶，特别是小于1 cm的肝癌和同时伴有肝硬化病人的肝癌尚有一定的困难[3-4]。近些年来，随着分子影像学(molecular imaging)研究的不断深入，为肝细胞癌的早期检测和早期诊断提供了一种全新的思维方法[5]。以下从分子影像学的角度对超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)纳米颗粒在肝癌磁共振早期诊断方面的应用进行综述。

1 分子影像基本原理

分子影像学是一门新兴的交叉科学，与传统影像学的不同点在于其能够将分子水平的改变在活体状态下显示出来，从而定性及定量的对分子改变所导致的生物学行为通过影像的方法进行分析，在组织、细胞及亚细胞等不同层面对疾病进行早期判断[6]。磁共振成像及CT成像等广泛使用的影像学诊断方法不能在形态学或组织学发生变化以前对疾病做出判断，这些手段只能够对分子改变所导致的最终的效应进行显示。分子影像学与之不同，能够在发生形态及解剖改变之前，对病变发生发展所产生的分子及细胞层面的改变进行早期监测，从而能够在病变的早期做出及时的判断，为疾病的诊疗提供有力的依据，极大地改变了以往的诊疗模式。

2 分子影像成像特征

分子影像的成像原理有3种，包括直接成像、间接成像、替代物成像。分子成像需要满足以下几点要求，一是需要有能够高速及清晰成像的技术；二是需要有具备一定亲和力和特异性的分子探针(molecular probe)；三是所选择的分子探针有穿过生物屏障的能力，这就需要该探针具有良好的生物相容性，从而达到进入靶细胞和靶器官的目的[7]。分子影像学与其他学科相比，有其自身的优势，一是能够发现疾病早期的分子层面的变化以及病理改变，这是相对传统检测手段的一个巨大进步；二是能够在活体上对疾病分子病理水平的改变进行监测，并且早期连续地对基因治疗和药物治疗的效果和机理进行观察；三是能够将复杂生物学过程变成直观的图像，更好地反映分子水平的机制及特征；四是能够在同一时间对多个分子事件进行监测。正是因为有了这些优势，在多种学科交叉的领域里，分子影像学已经成为了研究热点，其常用的成像技术主要有核医学成像、磁共振成像、光学成像等。

探测设备及分子探针是促进分子影像学提高的两个主要方面，在探测设备方面，需要不断提高技术，使成像的分辨率及敏感性得到提高，从而增加成像质量；在分子探针方面，需要开发出靶向性好的特异性探针。优质的影像分子探针需要具备与靶结构结合的特异性、一定的穿透性以及能产生良好的影像信号等特点[8-10]。纳米颗粒需要具备以下几个特点，才能够有可能成为活体状态下的分子成像探针，一是要有较大的表面积-容积比，颗粒较小；二是粒径分布范围窄；三是可以将不同的物质通过表面化学工程技术对其进行表面修饰，从而增加其功能；四是能够与较多的靶向配体结合，增加其与目标器官或组织的亲和性；五是具有较好的成像性质；六是具有较低的生物毒性，以及能够降解等。

3 SPIO的成像优势

临床上常用的磁共振对比剂是钆剂，有一定的诊断价值，能够增加病灶与正常组织之间的对比，反映病变的血供情况，从而提高诊断的准确率[11]，但钆剂在体内组织中呈非特异性分布，对早期肿瘤和较小的转移瘤诊断的敏感性不高，对肿瘤组织和正常组织的分界往往不能准确区分，并且有一定的肾毒性[12-13]。钆剂在脑、肾及血液系统的成像方面作用较明显，在肝胆系统的成像效果欠佳，因此，要进一步研究肝脏磁共振成像就需要进一步研究肝脏特异性对比剂。目前有两个主要研究方向，即网状内皮系统特异性对比剂以及肝细胞特异性对比剂[14]。

研究证明，氧化铁对比剂能检出微小病灶，提高恶性肿瘤的检出率，对肝脏肿块性病变的定性诊断有一定的帮助[15-16]。氧化铁对比剂由氧化铁晶体微粒包被而成，表面通常被覆多聚糖，使其在水的胶体溶液中具有稳定性[17]，直径从分布在十几到几千纳米之间，颗粒的大小对颗粒的摄入机制和磁化特性有直接的影响，根据颗粒直径可将其分为两大类[18]：一类是超顺磁性氧化铁，另一类是超小型超顺磁性氧化铁(U1trasmall superparamagnetic iron oxide,USPIO)。超顺磁性氧化铁直径为40纳米到150纳米之间[19]，主要被肝脾的网状内皮系统所摄入，在血浆的半衰期为8～10 min。超小型超顺磁性氧化铁颗粒直径为20～40 nm[19]，分布在网状内皮系统和血池，在血浆的半衰期为200 min，其表面包有较厚的高分子物质，这些物质能够减弱超小型超顺磁性氧化铁与血浆蛋白和调理素的作用，影响超小型超顺磁性氧化铁被吞噬细胞摄入，由于肿瘤转移的淋巴结内大部分为肿瘤细胞，对超小型超顺磁性氧化铁的吞噬减少，而正常淋巴结内与超小型超顺磁性氧化铁的亲和性不改变，超小型超顺磁性氧化铁被正常淋巴结所摄取，这种情况下，正常淋巴结与肿瘤转移的淋巴结之间的磁共振信号差别就可以显现出来，能够作为监测癌症患者淋巴结转移的一个手段，达到提高诊疗效果的目的[20-21]。

超顺磁性氧化铁具备良好的磁性、化学稳定性、表面活性及生物相容性，且制备简单，在材料、医药、生物技术以及催化领域都具有广泛的应用前景。应用最多的是Advance Magnetic公司生产的 AMI-25(Ferumoxides,商品名Feridex,菲立磁)，Feridex的平均直径为80 nm，其氧化铁晶体核心的直径为20 nm，作为在医疗市场使用的超顺磁氧化铁纳米粒制剂，菲立磁是第一个通过美国食品药品监督管理局批准的，并且是首个进入临床试验超顺磁氧化铁纳米粒制剂。它以铁氧化物为核心(粒径为20 nm)，其表面被葡聚糖-T10包裹，包被粒子流体粒径为120～180 nm之间，弛豫率R1=10.l/(mM·s)，R2=120/(mmol·s)，在血液中的半衰期约为8 min，静脉注射30 min后基本被人体肝脾网状内皮系统摄取，所摄取的80%以上被肝脏的肝窦壁上的枯否细胞吞噬，分布在脾脏的占6%～10%，静脉注射2 h后，肝脏SPIO的含量达到最高值，约为总量的89%[22]。在人体内可降解，在肝脏内的半衰期约为3～4d，给药后转移性肿瘤不摄取超顺磁氧化铁纳米颗粒，磁共振信号未见显著改变，与之相对的是，正常肝组织能够摄取超顺磁氧化铁，因此其磁共振信号降低，在肿瘤与正常肝组织之间形成信号差别，对较小的肿瘤有一定的诊断价值[23-24]。

4 SPIO纳米颗粒的特征

超顺磁氧化铁纳米颗粒具有以下特征：(1)有较窄的粒径分布范围，较小的粒径，较大的相对表面积。(2)可被多种物质修饰颗粒表面，例如对比剂、靶向配体、核酸等，使其具有多功能性。(3)一个纳米颗粒可结合多个靶向配体，增加其与目标受体之间的亲和力。(4)具有较低的毒性，具有生物可降解性。这些特征使得纳米颗粒具备作为活体分子成像探针的能力。

SPIO是磁共振阴性对比剂，包被葡聚糖右旋糖酐或其他物质的Fe3O4颗粒是其有效成分,具有网状内皮系统靶向性分布的特点，能够被网状内皮系统识别并且被吞噬细胞当作异物摄取。由于超顺磁氧化铁的这种特殊结构，在较弱的磁场可显示较强的磁性，当外加磁场消除后其磁性也很快消失，即所谓的超顺磁性。相对于传统的磁共振对比剂钆剂，SPIO具有很多优点，例如生物相容性较好，毒性较低，磁场敏感性较强，可以使质子弛豫率增强，使横向弛豫(T2)时间缩短[25]，从而使病变与周围组织的对比度增大，使图像的分辨率提高。肝脏网状内皮系统中含有Kupffer细胞，Kupffer细胞可以摄取超顺磁氧化铁，使正常肝组织的磁共振信号降低，由于Kupffer细胞在肝脏大部分恶性肿瘤中非常少或者缺乏，所以肝脏恶性肿瘤的磁共振信号无明显变化，这种情况下病变与正常肝组织的T2序列磁共振信号差别加大,产生磁共振负性强化。

5 SPIO磁共振成像的优化

Weissleder等[26]首先成功制备出标记阿拉伯半乳糖衣和去唾液酸胎蛋白的超顺磁氧化铁及超微型超顺磁氧化铁颗粒，使SPIO靶向聚集到肝组织的能力得到提高。张晓东等[5]制备半乳糖基白蛋白-SPIO，发现其主要作用于肝实质细胞，肝脏负性强化效应较好，有助于发现肝内的小肿瘤。焦志云等[27]制备壳聚糖-g-聚丙烯酸(CS-g-PAA)修饰的SPIO，并用1.5 T磁共振仪对其稳定性进行监测，发现磁共振信号在浓度低于20 mg/l时改变明显，T2*WI为最敏感的磁共振检测序列。Simon等[28]通过对细胞内外SPIO的弛豫率测定发现，细胞外游离的SPIO的T1和T2弛豫率明显高于细胞内，说明SPIO在细胞内外对MRI信号的影响是不同的。

Sun C等[29]以Fe3O4纳米颗粒(NPs)为核心，在外包裹聚乙烯乙二醇(poly-ethylene glycol,PEG)及氯离子通道蝎毒素(Chlorotoxin,CTX)，首次开发出了CTX-超顺磁纳米探针，研究显示该纳米颗粒可与胶质瘤细胞特异性结合，在磁共振显像中可以作为磁共振对比剂，可以提高肿瘤和正常脑组织之间的分辨性能，且没有急性的毒副作用。Veiseh O 等[30]2005年开发出一种多功能的纳米颗粒探针(NP-PEG-CTX-Cy5.5)，该微粒将Fe3O4纳米颗粒的表面覆以共价结合的PEG，然后将荧光分子Cy5.5与CTX分别共价结合在此颗粒上。该探针可以标记胶质瘤细胞，可以同时被MRI以及荧光显微镜检测。Veiseh M 等[31]将CTX与Cy5.5结合，产生复合物CTX-Cy5.5，通过小鼠胶质瘤模型尾静脉注入0.1 ml 20 μmol/L的CTX-Cy5.5，连续用小动物体内成像系统(Xenogen IVIS-100 system)观察14 d，发现肿瘤细胞种植部位的信号持续明显高于正常组织。2010年8月，该团队研制出一个纳米基因载体系统，该系统有聚胺基葡糖共聚体(a copolymer of chitosan)、GFP(green fluorescent protein)荧光染料、PEG、聚乙烯亚胺聚合体(PEI)以及CTX，采用共焦荧光显微镜以及Xenogen IVIS荧光成像对GFP的基因表达进行分析，采用组织病理学方法及磁共振对聚集在肿瘤部位的纳米粒子进行检测，CTX虽然对聚集在肿瘤部位的纳米粒子无明显影响，却可以对摄取的癌细胞产生高基因表达，这种纳米载体在提高基因治疗神经胶质瘤和其他致命的癌症方面是有潜力的[32]。2010年11月，Veriseh等[33]研究发现核糖核酸干扰(RNAi)治疗癌症是一种有潜力的方法，通过与该纳米探针结合，能有效地传递短干扰RNA(siRNA)，从而提高了治疗肿瘤的特异性。Veiseh O等[34]2009年合成了CTX修饰的SPIO-NPs纳米粒子，CTX对以下两种物质有亲和性，即氯离子通道的脂类复合物以及MMP-2，因此这种经过CTX修饰的纳米颗粒可以对细胞的摄取起到积极作用。

6 SPIO与肝癌靶向性的建立

在慢性肝炎和肝硬变的肝组织内，MMP-2的表达较弱[35]，而在肝癌中MMP-2有较高的表达，并且肿瘤的侵袭性、分化程度、转移及复发趋势能够影响此种表达[36-37]。洪坚善等[38]发现MMP-2在肝癌中的表达比正常组织和癌旁组织都高,并且与两者的差异有统计学意义，而MMP-2在正常组织和癌旁组织中表达之间差异无统计学意义，此外癌组织中MMP-2的表达与术后复发时间呈负相关，与肝外转移呈正相关，与病理学分级呈正相关。Cui J等[39]发现MMP-2与肝细胞癌切除术后复发有密切关系。白旭明等[40]研究显示兔肝VX2移植瘤MMP-2表达与人肝细胞癌相似。因此，MMP-2有成为肝癌靶点的潜质。

CTX是一种从以色列金蝎的毒液中提取、包含36个氨基酸(其中包含1个酪氨酸残基、8个半胱氨酸残基)和4个双硫键的多肽，分子重量为3950Da，其中酪氨酸残基可以进行放射性碘标记[41]。氯离子通道蝎毒素可选择性和特异性与MMP-2结合[42]，而MMP-2在肝癌中高表达，故氯离子通道蝎毒素就可以通过MMP-2与肝癌建立起靶向联系。

PEG[43-44]是一种常用的表面修饰材料，具有很好的亲水性，同时没有免疫原性，PEG便宜易得，呈中性，无明显毒性，有良好的生物相容性，溶于水和多种有机溶剂，能够通过端基反应性以嵌段或接枝的方法连接到纳米颗粒上，使其具有亲水性，增强其稳定性，延长在血液内的循环时间，减少纳米颗粒被巨噬细胞的吞噬。因此，通过PEG的表面修饰作用，可以使SPIO与CTX和MMP-2相结合，从而建立SPIO与肝癌之间的靶向性。

7 展望

以上研究说明，经过CTX修饰的SPIO纳米颗粒能够通过MMP-2与肝癌建立靶向联系，据此可设计出与肝癌靶向结合的超顺磁纳米颗粒，作为肝癌的磁共振特异性对比剂，实现SPIO分子探针应用到肝癌早期磁共振诊断的目的。这种研究已经引起国内外广泛关注，但尚无深入的研究成果，需要更多的学者更加深入的研究。

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