离体心肌细胞损伤模型研究进展

2015-02-20李庆玲刘小龙王楚盈李玉梅张大方

长春中医药大学学报 2015年3期

赵帅，李庆玲，韩旭，刘小龙，王楚盈，李玉梅，张大方

(长春中医药大学研究生院，长春130117)

据世界卫生组织统计，心脑血管疾病已成为威胁人类生命健康的重要因素之一，其发病率仍在逐年攀升，病死率一直位居榜首。随着科技的进步，大量中外学者对心脑血管疾病的研究不断细化、深入，由于体内神经和内分泌系统的调节，在体模型很难准确地反映出致病因素对心肌细胞损伤的影响。而体外心肌细胞培养具有条件可控、样本均一、费用经济、便于观察与记录等优势［1］，近些年来常被用于药物或因子对心肌细胞损伤的研究中，填补了在体模型的不足。因此，找到适用于实验的离体心肌细胞损伤模型至关重要。现就离体心肌细胞损伤模型简要论述如下。

1 缺氧复氧损伤模型

心肌细胞缺氧复氧损伤模型是目前离体心肌细胞培养领域应用频率最高的心肌细胞损伤模型之一。此模型适用于体外模拟临床治疗缺血性心肌病所导致的缺血再灌注的病理损伤。该模型的优势在于排除体内其他因素干扰，可直观的观察条件或药物对受损心肌细胞的形态、功能、代谢等的影响，更确切的推断出药物的作用机制，是筛选临床抗心肌缺血再灌注损伤药物的最佳模型。但值得注意的是，单纯的缺氧损伤并不等同于临床上心肌缺血再灌注损伤，还要配合缺糖模型，以模拟心肌缺血的状态。目前制作缺氧复氧损伤模型分物理、化学两类方法。

1.1 物理缺氧法最常见的建立缺氧复氧模型的方法是由WEBESTER K W等［2］改进而来的混合气体培养法。这种方法用D-Hank's液取代培养液，并将细胞放于密闭容器内通入含95%N2和5%CO2的混合气体培养来建立缺氧环境，而后用含小牛血清的DMEM替换D-Hank's液，放回含5%CO2的培养箱中复氧。李丽静等［3］使用无菌自制密闭容器，用Earle's液替换培养液，通入95%N2与5%CO2混合气体，经2 h缺氧培养后复氧，并对细胞存活率、细胞凋亡率及Beclin-1蛋白表达量进行了检测，从而证明了参附汤血中移行成分对缺氧复氧损伤的心肌细胞有保护作用。刘哲等［4］使用5%CO2加95%N2混合气体与无血清低糖DMEM培养液置于培养箱中模拟缺氧环境2 h，再于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液、5%CO2环境中复氧，用于研究西洋参皂苷对缺血再灌注损伤的影响。魏璨等［5］将高纯度N2直接通入低糖DMEM培养液中达到饱和，再放入5%CO2培养箱中培养2 h，复氧时直接将缺氧的培养液换为含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液继续培养24 h即可。

另有研究者沿袭KOYAMA等［6］方法配制缺氧(缺血)液和复氧(再灌)液以建立缺氧复氧损伤模型［7］。薛江波［8］用 NaH2PO4、NaHCO3、CaCl2、Mg-SO4、HEPES、NaCl、KCl、乳酸钠配制缺氧溶液以置换正常培养液，并于使用前通入N2饱和，从而模拟出缺氧环境。再用 NaCl、KCl、NaH2PO4、NaHCO3、CaCl2、MgSO4、葡萄糖、HEPES制成复氧溶液，并预先用氧气饱和，置换出缺氧溶液模拟出复氧环境。

液体石蜡覆盖避氧法也是常见的建立细胞缺氧复氧模型的物理方法之一。其原理是利用液体石蜡强亲脂性隔离细胞与氧气，达到缺氧效果。吸出石蜡换上正常培养液培养即是复氧。该方法操作简单安全，但由于液体石蜡不易清洗，标本显微镜下观察易受到石蜡滴的影响［9］。

1.2 化学缺氧法 Na2S2O4、CoCl2及NaN3是常用化学制缺氧方法的试剂。其中Na2S2O4是一种耗氧剂，可以在不损伤细胞的情况下迅速清除培养基中的O2造成缺氧效果，若想复氧，移除现有培养基重新注入正常培养基即可。缺点在于不便于细胞指标的检测。CoCl2与NaN3则均通过影响与呼吸相关的酶来间接达到细胞缺氧的目的。由于CoCl2所致缺氧原理与临床心肌缺血存在差异，因此仅应用于研究心肌细胞缺氧状态下细胞凋亡与保护的调控机制。NaN3可抑制细胞色素C氧化酶，阻碍呼吸链反应，但很难恢复受损的细胞活性，适于研究缺氧刺激对心肌细胞的影响，但NaN3的较大毒性使其应用受限［10］。

物理、化学两类方法各有缺点，物理缺氧法虽较化学缺氧法省时，但难于控制实验条件、保持缺氧状态的平衡与维持。化学缺氧法所用化学试剂的剂量及时间难以统一，还易受化学药物不稳定及浓度等因素影响。因此要根据具体情况选择适合的造模方法。

2 H2O2损伤模型

H2O2心肌细胞损伤模型与心肌的氧化应激反应相关。H2O2是一种可以对心肌细胞造成损伤的活性氧(ROS)自由基。活性氧是一类在细胞呼吸及代谢过程中产生的氧的单电子还原产物，一方面具有信号转导和调控细胞活动等生理功能，另一方面过量的产生与堆积会引起生物大分子的过氧化反应，导致细胞结构及功能的破坏，造成细胞坏死或凋亡等不可逆性细胞损伤。临床上，心肌缺血过程中会发生复杂的氧化应激反应，而氧自由基及其引起的脂质过氧化是造成心肌损伤的启动因素［11］。因此，H2O2心肌细胞损伤模型常被用于模拟临床心肌缺血再灌注损伤，或用于研究药物的抗氧化作用。由此，也有研究者将此模型归类为缺氧复氧损伤模型的化学方法。

H2O2心肌细胞损伤模型的优势在于诱导剂经济易得，操作简单;但H2O2化学性质活泼，遇碱、遇强光易分解，不易保持模型的稳定。杨翠等［12］用终浓度为100 μmol/L的H2O2建立大鼠乳鼠心肌细胞损伤模型，推断出人参皂苷Rb1对心肌细胞损伤的保护机制可能与ERK信号通路的激活相关。杨萍等［13］以200 μmol/L 的 H2O2作用乳鼠心肌细胞 2 h造模，证实丹参酮ⅡA可通过增强细胞抗氧化酶活力，抑制H2O2诱导的心肌细胞损伤。

3 阿霉素损伤模型

阿霉素，又名多柔比星，是一种广谱高效的抗肿瘤药物。由于阿霉素对心肌的亲和力远高于其他组织，因此用药时会附带如心律失常、心力衰竭等明显的心脏毒副作用。对于阿霉素的致毒机制目前尚没有形成统一的说法，而广泛被人们所接受的是自由基理论。其对心肌细胞的损伤与临床药源性心肌坏死吻合，有别于正常心力衰竭等病症所造成的损伤，因此建立阿霉素诱导的心肌细胞损伤模型多适于研究探索既能不降低阿霉素抗肿瘤活性又能对临床药源性心肌细胞损伤起到保护作用的药物。代渊等［14］采用乳鼠心肌细胞培养法，通过MTT法对心肌细胞存活率、Western blot法对NF-κB p65和JNK磷酸化水平的检测发现，知母宁具有抗阿霉素心肌毒性作用，并由此推断其保护心肌细胞作用与抑制NF-κB和JNK通路的磷酸化水平具有一定的关联性。陈莉莉等［15］用浓度为10 μmol/L阿霉素作用24 h建立心肌细胞损伤模型，发现人参皂苷 Rg3可降低 Fas及Bax/Bcl-2mRNA的表达，有利于拮抗化疗药物阿霉素所致大鼠乳鼠心肌细胞损伤。

4 乌头碱损伤模型

乌头碱是比较常见的建立心肌细胞心律失常损伤模型的诱导药物，具有强心作用的同时也可导致心律失常，且有效剂量与中毒剂量相近。所以在使用乌头碱治疗疾病时常配伍其他药物来减轻其毒性，由此可知，此模型更适用于筛选保护心肌的药物与抗心律失常药物。王茁伉等［16］研究发现，浓度为1 μmol/L与2 μmol/L的乌头碱能明显促进细胞内Na+含量增加，1.5 μmol/L乌头碱能明显抑制细胞Na+-K+-ATP酶活力，有降低细胞Ca2+-ATP酶活力的趋势，从而验证了该模型与心律失常发生机制基本一致。王衍堂等［17］通过实验得出乌头碱浓度＞1 μg/mL时心肌细胞的存活率显著且随浓度升高而降低，MDA含量随剂量的增加而升高。董晞等［18］通过浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mmol/L 的梯度设计，筛选乌头碱对心肌细胞作用最佳造模浓度，并验证出，甘草苷改善了乌头碱对心肌细胞钾、钙离子通道编码基因的异常表达，从而减轻乌头碱的毒性作用。

5 AngⅡ损伤模型

AngⅡ具有生长因子样的作用，是RAAS系统中主要的生物活性物质之一，被认为是导致心肌重构的关键因素。在生物体内，肾素－血管紧张素－醛固酮系统(RAAS)可通过AngⅡ与受体结合，多途径促进血管壁增厚、血管收缩、醛固酮分泌增加、水钠潴留，诱导胚胎基因表达、心肌细胞肥大及心肌纤维化、成纤维细胞增殖，导致心脏重构。目前AngⅡ与AT1受体结合模型已接近成熟，并被广泛应用于诱导建立体外乳鼠心及细胞肥大模型。但AngⅡ价格略显昂贵。杨雷［19］、毛秉豫［20］等通过光镜下对细胞直径的观察，确立了浓度为10－6g/L的AngⅡ诱导心肌肥大模型的成立，并检测了心肌细胞蛋白质含量与PKD1 mRNA的表达，得出结论，中药提取物可通过下调PKD1 mRNA的表达而抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。陈建康等［21］用浓度为10－6mol/L的AngⅡ造模，证明吡哆胺和替米沙坦均可改善氧化应激，协同下调大鼠心肌细胞RAGE mRNA的表达，且吡哆胺较替米沙坦作用更强。

6 异丙肾上腺素损伤模型

近年研究表明，心脏局部的生物活性物质如AngⅡ、儿茶酚胺类、胰岛素样生长因子、一氧化氮等在心肌肥大的产生中扮演着重要的角色。异丙肾上腺素属于人工合成的儿茶酚胺类药物，可以促使心肌细胞钙超载，心率收缩力增强，氧自由基损伤，导致心肌缺血。此模型表现与临床扩张型心肌病、缺血性心脏病相似，常被应用于体内或体外建立心肌细胞肥厚模型。

杨娟等［22］以10 μmol/L浓度的异丙肾上腺素建立出生乳鼠心肌细胞肥大模型，通过RT-PCR法与Western blotting法检测，发现黄芪甲苷对异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大的抑制可能与TLR4/NF-κB信号通路有关。高杉等［23］通过实验证明，浓度为10－5mol/L的异丙肾上腺素能明显诱导心肌细胞肥大，并证明低聚葡萄籽原花青素可剂量依赖性地抑制该模型下的细胞内氧自由基生成，降低MDA含量，提高SOD活性，从而达到抑制心肌细胞肥大的作用。

7 结语

离体心肌细胞培养能最大限度的克服实验动物的个体差异，并保留细胞完善的生理功能及电生理特性，排除了机体通过神经体液及激素对实验结果的干扰，使细胞代谢相较于在体实验更加稳定，但也造成其不能真实代表细胞来源的组织，是离体细胞培养的弊端所在。另外，离体细胞培养实验相较于在体实验成本低、周期短、操作简单，在药物筛选、研发和机制研究中可以广泛应用。但任何一种模型都无法完全模拟出临床上心血管疾病复杂的病理变化，因此研究者需要根据实验目的，选择致病机制相近的模型，并结合在体实验综合分析才能得到更完善、真实的实验结论。

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