典则分析研究柴胡达原饮不同煎煮方式对化学成分溶出的影响

王淑玲,余向军,詹怡飞,赵振坤,庞潇卿,谢　恬,曾昭武,4

(1．杭州师范大学医学院，浙江 杭州 310036；2.淳安县枫树岭镇综合农技服务中心，浙江 杭州 311717； 3.杭州民生药业集团有限公司，

浙江 杭州 310012；4.大连华立金港药业有限公司，辽宁 大连 116000)

典则分析研究柴胡达原饮不同煎煮方式对化学成分溶出的影响

王淑玲1,余向军2*,詹怡飞3,赵振坤1,庞潇卿1,谢恬1,曾昭武1,4

(1．杭州师范大学医学院，浙江 杭州 310036；2.淳安县枫树岭镇综合农技服务中心，浙江 杭州 311717； 3.杭州民生药业集团有限公司，

浙江 杭州 310012；4.大连华立金港药业有限公司，辽宁 大连 116000)

摘要：研究柴胡达原饮多种分煎、合煎方式对柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚5种成分溶出的影响.将柴胡达原饮方中10味中药材，按照君臣佐使分为4组：A(黄芩、柴胡)，B(枳壳、桔梗、厚朴、草果、青皮、槟榔)，C(荷叶)，D(炙甘草).按照排列组合排成15种组合方式.采用UFLC检测提取液中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的含量.运用SAS 9.1对数据进行相关分析和综合评判.结果发现：5种成分均能达到基线分离，各成分均有较宽的线性范围和良好的线性关系；枳壳在合煎、分煎中受到的影响与青皮、厚朴是不同的；较佳组合为ACD+B，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的含量分别为1.3130、0.6370、1.9420、0.8786、0.6110 mg/mL.ACD+B方式分煎，5种成分的溶出最大；相关分析能较好地揭示各组分的相互关系.

关键词：柴胡达原饮; 合煎; 分煎; 相关分析; 综合评价法

柴胡达原饮，现代多用于治疗流行性感冒、夏秋季无名高热及不明原因的发热而症见寒热往来，胸膈痞满，苔白厚腻，脉弦滑者，疗效较好.处方由清代医家俞根初首创，出自《重订通俗伤寒论》，由柴胡、黄芩、枳壳、青皮、厚朴、桔梗、草果、槟榔、荷叶、炙甘草组成.以柴芩为君者，以柴胡疏达膜原之气机，黄芩苦泄膜原之郁火也.臣以枳、桔开上，朴、果疏中,青、槟达下，以开达三焦之气机，使膜原伏邪从三焦而外达肌腠也.佐以荷透之；使以甘草和之.整个处方透表清里，宣畅三焦，透达募原.枳壳、青皮、厚朴均为此方中的臣药.柚皮苷、新橙皮苷是枳壳的主要药用成分；橙皮苷是青皮的主要药用成分；厚朴酚、和厚朴酚是厚朴的的主要药用成分.本文通过测定15种组合方式所煎汤剂中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚的含量，研究15种组合方式对这5种成分溶出的影响，选择溶出度综合评价值高的组合方式对于提高全方药效具有重要意义.

1仪器与材料

超高效液相色谱仪、工作站及紫外检测器(日本Shimadzu公司)；FA1100型电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)；甲醇(色谱纯，天津四友)，水为去离子双蒸水(实验室自制)；柚皮苷对照品(10236472)由中国药品生物制品鉴定所提供，橙皮苷、新橙皮苷(10191201111)、厚朴酚、和厚朴酚(10191201203)由南昌贝塔生物科技有限公司提供；磷酸(分析纯，杭州大方化学试剂厂).药材经杭州师范大学王淑玲鉴定，柴胡为伞形科多年生草本植物北柴胡(BupleurumsinensesDC.)和狭叶柴胡(南柴胡BupleurumsachalinenseFr.Schm)的干燥根；黄芩为唇形科植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根；枳壳为芸香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培变种的干燥未成熟果实；青皮为芸香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)及其栽培变种的干燥幼果或未成熟果实的果皮；厚朴是木兰科植物厚朴(MagnoliaofficinalisRehd.et Wils)或凹叶厚朴(MagnoliaofficinalisRehd. et Wils. var. bilobaRehd. et Wils)的干燥干皮、根皮及枝皮；桔梗为桔梗科植物桔梗(Platycodongrandiflorum( Jacq.) A.DC.)的干燥根部；草果是姜科豆蔻属植物草果(Amomumtsao-ko)的干燥成熟果实；槟榔为棕榈科植物槟榔(ArecacatechuLinn.)的干燥种子；荷叶是睡莲科植物莲(NelumbonuciferaGaerth.)的叶；炙甘草为豆科植物甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)、胀果甘草(GlycyrrhizainflateBat.)或光果甘草(GlycyrrhizaglabiaL.)的干燥根及根茎.切厚片.切片，蜜炙[1].以上药材均符合2010版中国药典标准，由华东大药房提供.

表1　梯度洗脱条件

2方法与结果

2.1　色谱条件

色谱柱为Spherisorb C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，进样量15 μL，体积流量1.0 mL/min，柱温40 ℃，检测波长294 nm，流动相为乙腈-水，梯度洗脱条件见表1.

在此色谱条件下，样品中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚相应峰分离良好，且阴性对照无干扰.

2.2　对照品溶液的制备

精密称取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚等对照品适量，干燥后，精密称定，加色谱级甲醇定容，配制成56、144、88、48、44 μg/mL的混合对照品溶液，备用.

2.3　样品溶液的制备

柴胡达原饮处方由柴胡15 g、黄芩15 g、枳壳15 g、青皮15 g、厚朴15 g、桔梗15 g、草果6 g、槟榔10 g、荷叶10 g、炙甘草6 g共10味中药材组成.方中饮片按君臣佐使组方原则分为4组：A(黄芩、柴胡)，B(枳壳、桔梗、厚朴、草果、青皮、槟榔)，C(荷叶)，D(炙甘草).按照排列组合法，共有15种组合方式(ABCD，A+B+C+D，AB+C+D，AC+B+D，AD+B+C，BC+A+D，BD+A+C，CD+A+B，AB+CD，AC+BD，AD+BC，ABC+D，ABD+C，ACD+B，BCD+A).

将处方中药材分别粉碎，按处方比例称取10～20目之间粗粉，进行提取.提取3次，时间依次为30、15、15 min，提取温度为100 ℃.加水量分别为中药量的10、8、8倍.提取液分别用4层纱布滤过，分别离心(3 000 r·min-1，20 min)，合并上清液，减压浓缩并定容.ABCD、B、AB、BC、BD、ABC、ABD、BCD的提取液减压浓缩定容至500 mL；A、C、D、AC、AD、CD、ACD的提取液减压浓缩定容至100 mL.吸取ABCD提取液1 mL，至10 mL容量瓶中，加色谱级甲醇定容，摇匀，得ABCD样品液；从A、B、C、D提取液中分别吸取1、5、1、1 mL.摇匀后吸取1 mL至10 mL容量瓶中，加色谱级甲醇定容，得A+B+C+D样品液；以此类推制备15种组合方式的样品液.分别过0.22 μm 微孔滤膜，取续滤液，即得15组供试液.

2.4　阴性对照溶液的制备

按处方比例分别制备缺枳壳、青皮、厚朴的阴性样品，按2.3项操作，得阴性对照溶液，依2.1项测定.结果阴性对照在柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚相应保留时间处无干扰.

2.5　线性关系考察

取制备的混合对照品溶液，进样量依次为1、3、5、10、20 μL，依2.1项测定.以各对照品峰面积为纵坐标，质量(μg)为横坐标进行线性回归，得回归方程为：柚皮苷y=1 300 690x+18 161(r=0.9995)，橙皮苷y=1 254 040x+42 902(r=0.9995)，新橙皮苷y=624 020x+13 852(r=0.9997)，和厚朴酚y=124 912x-12 202(r=0.9999)，厚朴酚y=138 888x-2 612.7(r=0.9999).结果表明柚皮苷在0.28~5.6 μg，橙皮苷在0.44~8.8 μg，新橙皮苷在0.44~8.8 μg，和厚朴酚在0.24~4.8 μg，厚朴酚在0.22~4.4 μg线性关系良好.

2.6　精密度试验

精密吸取混合对照品溶液15 μL，连续进样6 次，依2.1项测定.计算得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚峰面积的RSD分别为0.86%、1.13%、2.02%、1.73%、1.32%，表明仪器精密度良好.

2.7　稳定性试验

取ABCD组供试液，分别在 0、2、4、6、8、12 和 24 h，按2.1项下色谱条件测定，测得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚峰面积RSD分别为 1.49%、0.81%、0.89%、0.76%、1.85%，表明样品溶液 24 h 内稳定性良好.

2.8　重现性试验

取ABCD组6份，按2.3项操作制备供试液，按2.1项下色谱条件测定，记录峰面积.测得样品中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚峰面积RSD 为1.23%、2.02%、1.07%、1.10%、1.40%.结果表明测定方法重现性良好.

2.9　回收率试验

取已知含量的ABCD组供试液6份，每份1 mL，分别按照下表2加入对照品，摇匀，过0.22 μm 微孔滤膜，取续滤液，依2.1项测定.结果见表2.

表2　回收率试验结果

2.10　样品含量测定

取2.3项方法制备供试品溶液(图谱如图1-图5所示,其中：1—柚皮苷；2—橙皮苷；3—新橙皮苷；4—和厚朴酚；5—厚朴酚)，分别进样测定，每份平行测定3次，外标一点法计算，取平均值.结果见表3.

图1　混合对照品图谱Fig. 1　Mixed standard map

图2　缺枳壳阴性对照图谱Fig .2　Auranth fructus negative control map

图3　缺青皮阴性对照图谱Fig. 3　Citri reticulatae pericarpium viride negative control map

图4　缺厚朴阴性对照图谱Fig. 4　Magnoliae officinalis cortex negative control map

图5　样品图谱Fig. 5　Samples map

表3　15种组合方式中5种成分的含量

2.11　5种成分之间的相关性分析

运用SAS9.1[2]系统研究5种成分两两之间的相关性，结果见表4.

表4　5种成分两两之间的相关性

注：r表示相关系数;*P<0.05,**P<0.01.

由表4可知:柚皮苷和新橙皮苷存在相关性；新橙皮苷与和厚朴酚、厚朴酚存在相关性；和厚朴酚与厚朴酚存在相关性.由于这些成分均存在于臣药B中，它们存在相关性说明分煎、合煎方式对它们溶出的影响是一致的.同时，橙皮苷对和厚朴酚与厚朴酚都有相关性，对柚皮苷和新橙皮苷都没有相关性，说明橙皮苷、和厚朴酚与厚朴酚受到的影响是一致的.而柚皮苷对和厚朴酚与厚朴酚无相关性，新橙皮苷对和厚朴酚与厚朴酚有相关性，前面已知柚皮苷和新橙皮苷有相关性，说明此方法分析相关性具有一定的局限性.

表5　3种药材的典则相关分析

注：r表示典则相关系数；*P<0.05,**P<0.01.

由于柚皮苷和新橙皮苷存在相关性，和厚朴酚与厚朴酚存在相关性，柚皮苷和新橙皮苷是枳壳的主要药用成分，和厚朴酚与厚朴酚是厚朴的主要药用成分，将5种成分分为三组：柚皮苷和新橙皮苷、橙皮苷、和厚朴酚与厚朴酚.对这三组数据两两进行相关分析，即是对药材枳壳、青皮和厚朴进行相关分析.利用SAS统计软件对两组变量间进行相关分析即典则相关分析(canonical correlation analysis)，反应两组变量的相关本质.分析结果见表5.

2.12　综合评价法选择较优的组合方式

表6　综合评判Y值

由上表可知，Y值最高的组合为ACD+B.

3讨论

1) 15种组合方式供试液的色谱峰个数一致，说明该条件下，未检出合煎、分煎方式产生的新化合物[3-4].

2) 运用SAS9.1系统研究5种成分两两之间的相关性，具有一定的局限性.利用SAS统计软件中对两组变量间进行典则相关分析，在数据分析上，反应两组变量的相关本质.青皮和厚朴存在相关性；枳壳和青皮、厚朴的相关性不显著.可以认为枳壳在合煎、分煎中受到的影响与青皮、厚朴是不同的.另外，组合对各味药其他成分的影响，对整体药性的影响以及煎出液的药效方面的影响，还需要进一步深入研究.

3) 但从5种成分煎出量角度分析，利用综合评价法选择较优的组合方式，Y值最高的组合为ACD+B.而且，B分煎时的Y值要明显大于B与其他组分合煎，表明B分煎更有利于药用成分的溶出.

参考文献:

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2010.

[2] 阮敬.SAS统计分析从入门到精通[M].北京:人民邮电出版社,2009.

[3] Satoh H. Pharmacological characteristics of Kampo medicine as a mixture of constituents and ingredients[J]. J Integr Med,2013,11(1):11-16.

[4] Islam M K, Mahmud I, Saha S,etal. Preliminary pharmacological evaluation of Alocasia indica Schott tuber[J]. J Integr Med,2013,11(5):343-351.

On the Effects of Different Decoction of Chaihudayuan Decoction on the Extract of

5 Chemicals by Canonical Correlation Analysis

WANG Shuling1, YU Xiangjun2, ZHAN Yifei3, ZHAO Zhenkun1, PANG Xiaoqing1, XIE Tian1, ZENG Zhaowu1，4

(1.Medical College, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China; 2.Agro-technical Station of Fengshuling Town,

Hangzhou 311717, China; 3.The People’s Livelihood Pharmaceutical Co., Hangzhou 310012, China;

4.Dalian Holley Kingkong Pharmaceutical Co.,Ltd., Dalian 116000, China)

Abstract:This paper studies the effects of different mixed and separated decoction of Chaihudayuan Decoction on the extract of 5 chemicals, naringin, hesperidin, neohesperidin, honokiol and magnolol. The 10 medicinal herbs used in Chaihudayuan Decoction are divided into 4 groups according to monarch, minister, assistant and guide. The 4 groups have 15 different decoctions and the contents of the 5 chemicals are determined by UFLC. The data is analyzed by SAS 9.1. The results show that the 5 chemicals are well separated and show good linearity. Hovenia dulcis is affected in combined decoctions and separated decoctions differently from green husk, magnolia bark. The best composition is ACD+B, and the contents of naringin, hesperidin, neohesperidin, honokiol and magnolol are 1.313, 0.6370, 1.942, 0.8786, 0.6110 mg/mL respectively. The separated decoction ACD+B is proper for the 5 chemicals. The correlation analysis can deeply reveal the relations between the compositions.

Key words:Chaihudayuan Decoction; mixed decoction; separated decoction; correlation analysis; comprehensive evaluation

第14卷第1期2015年1月杭州师范大学学报(自然科学版)JournalofHangzhouNormalUniversity(NaturalScienceEdition)Vol.14No.1Jan.2015

*共同第一作者

文章编号:1674-232X(2015)01-0049-06

中图分类号:R284. 1

文献标志码:A

doi:10.3969/j.issn.1674-232X.2015.01.009

通信作者：王淑玲(1972-)，女，讲师，博士，主要从事中药新技术、新制剂、新剂型、中药复方研究.E-mail：wsling222@163.com

基金项目:杭州市科技发展计划项目(20130432B05，20131232i37)；辽宁省 “百千万人才工程”资助项目(2013921005)；大连市科技计划项目(2013E11SF052).

收稿日期：2014-05-17