戊四氮诱导癫痫大鼠脑N-cadherins和NT-4的变化及灵芝酸的干预作用①

王芳芳, 谭风雷,姜 阳，马小茹，刘 蕾,刘君星, 梁衍锋, 吴佳梅,王淑湘,王淑秋

(1.佳木斯大学基础医学院 ，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学临床医学院 ，黑龙江 佳木斯 154007；3.佳木斯市中心医院，黑龙江 佳木斯 154002)

戊四氮诱导癫痫大鼠脑N-cadherins和NT-4的变化及灵芝酸的干预作用①

王芳芳1, 谭风雷2,姜 阳3，马小茹1，刘 蕾1,刘君星1, 梁衍锋1, 吴佳梅1,王淑湘1,王淑秋

(1.佳木斯大学基础医学院 ，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学临床医学院 ，黑龙江 佳木斯 154007；3.佳木斯市中心医院，黑龙江 佳木斯 154002)

目的：观察戊四氮(PTZ)诱导大鼠癫痫后脑神经型钙粘附素(N-cadherins)和神经营养因子-4(NT-4)变化及应用灵芝酸进行干预与治疗，主要研究灵芝酸预防和治疗癫痫的痫性发作的机理。方法：采用健康的雄性Wistar实验大白鼠33只，按随机分配原则分成正常对照组、癫痫模型组和灵芝酸治疗组每组11只。癫痫模型组与灵芝酸治疗组均采用诱导癫痫亚惊厥发作剂量腹腔注射戊四氮制备Wistar大白鼠慢性点燃痫性模型。在实验室冰盒低温条件下迅速提取大鼠脑组织，采用Western-Blotting方法检测大鼠脑N-cadherins和NT-4的变化。结果：实验性诱导癫痫大鼠痫性模型制备成功，灵芝酸治疗组和癫痫模型组实验动物都达到癫痫点燃的实验标准，与癫痫模型组动物相比，灵芝酸组大鼠潜伏期明显延长，但持续时间之间的差别没有显著性。实验检测Western-Blotting结果发现：PTZ诱导癫痫发作后N-cadherins蛋白表达水平明显高于正常对照组，差异有显著性 (P<0.01)；用灵芝酸干预后，N-cadherins的表达有明显下降，差异有显著性 (P<0.01)，癫痫模型组大鼠脑NT-4蛋白含量比正常对照组蛋白含量升高，差异具显著性(P<0.05)；灵芝酸组大鼠脑NT-4蛋白含量较癫痫模型组蛋白含量升高，差异具显著性(P<0.05)。结论：灵芝酸作用癫痫大鼠后N-cadherins蛋白表达降低，调整机体病变神经元的兴奋性，灵芝酸还能够增强NT-4的表达从而减轻癫痫发作给神经系统造成的损伤，从而起到抗癫痫作用。

癫痫；戊四氮；N-cadherins；NT-4；灵芝酸

癫痫(epilepsy,EP)是一种神经系统功能紊乱现象[1,2]，是中枢神经系统功能疾病，其仅低于脑血管疾病的第二大顽故病症，对人类的健康产生严重威胁。据WHO2001 的有关数据显示，全世界约有 1%的人经受着癫痫疾病的困扰(WHO2001)，至今癫痫的治疗及防护主要还是通过药物为主导，但癫痫治疗与预防的药物发展速度相当迟缓。神经型钙粘附素(N-Cadherin)是最早在钙粘附素家族中枢神经系统中发现的有效成员之一[3]，中枢神经系统神经突触形成在研究发现其与轴突生长起着至关重要的作用。神经营养因子4(neurotrophin-4，NT-4)实验研究发现其具有促进神经元的分化、生长与成熟，有效维持神经元的存活有很重要的功效，又验证其可以通过促进脑神经损伤后的修复与再生研究方面发挥着明显的效用[3]。灵芝酸(GanodermaAcid，GA) 是灵芝的主要成分之一，至今为止从分离赤芝占有很高的比例， 目前研究不同种类灵芝中分离到的三萜类化合物已达百种以上[4]。灵芝酸有良好的生物活性[5]，①抗肿瘤②抗高血压③降血脂④抗炎症反应⑤免疫调节⑥促进智力和延缓衰老。但是由于种类的繁多，针对灵芝酸各单独化合物具体实际药理作用并未完全认定。本研究即探讨灵芝酸干预戊四氮诱导大鼠癫痫脑组织N-cadherins和NT-4的含量变化,阐明灵芝酸抗癫痫作用。

1 材料和方法

1.1 主要实验试剂与仪器

戊四氮 网上订购美国的Sigma公司；(兔抗大鼠)的N-cadherins多克隆抗体、(兔抗大鼠)的NT-4多克隆抗体和简装PBS缓冲液试剂，均网上采购于武汉博士德生物工程有限公司；SABC试剂盒，购于武汉博士德生物工程有限公司。EPS-100电泳仪，购于上海天能科技有限公司制造；GIS凝胶图像处理系统，购于上海天能科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备和实验后动物的处理

选取实验用健康雄性Wistar大鼠33只，体重171～205g，由大连医学院动物实验中心提供。按随机分配原则将实验大鼠分成3组：分别为正常对照组、戊四氮诱导癫痫模型组和灵芝酸干预治疗组，每实验组11只大鼠。实验参考Morgan等[6]的方法但做了相应的改动。用新鲜生理盐水与PTZ完全溶解配制成注射浓度为10g/L的溶液。分别给予致亚惊厥剂量PTZ(35mg/kg)腹腔注射至灵芝酸治疗组和癫痫模型组，每日给药1次，持续注射28d；正常对照组实验大鼠采用等容新鲜生理盐水代替戊四氮腹腔注射。灵芝酸组腹腔注射PTZ的同时再经灌胃一定浓度灵芝酸溶液，每日给药1次，连续给药28d；癫痫模型组实验大鼠与正常对照组实验大鼠同时经灌胃给予同体积新鲜生理盐水。停药7d后，再给等同剂量的PTZ进行点燃测试癫痫[7]。

1.2.2 观察实验大鼠在行为上变化

实验大鼠癫痫发作评价给分标准[3,8,9]：0级，在行为上无显著发作反应；Ⅰ级，出现规律性点头或头面部有抽动；Ⅱ级，会有点头甩尾或伴有阵挛性咀嚼；Ⅲ级，头部出现颤搐并伴随着前肢阵挛性抽搐；Ⅳ级： 出现站立袋鼠样姿势和或伴随多肢抽动；Ⅴ级，发生全面多发性持续强直-阵挛性发作。实验中每日对注射PTZ后每只大鼠监测15～55min，记录本随时跟踪记录癫痫发作的级别、癫痫发病的潜伏期(s)和癫痫发病痫性发作持续时间(s)，凡持续发生5dⅡ级以上癫痫痫性发作的实验大鼠都可定为复制成功标准[3]。

1.2.3Western-Blotting检测

实验室内低温冰盒条件下取实验动物海马组织，快速电子称称重后，迅速匀浆。低温冰盒4℃条件下裂解30min，4℃离心机设置12000r/min状态下离心15～20min，吸取上清液分装；用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测实验定样品蛋白的表达；在低温冰水混合物的条件下转膜1h；反复用常温TBST液漂洗3次；进行封闭孵育1h置于室温37℃条件平缓摇床内；再用常温TBST液反复冲洗3遍；加入Ⅰ抗低温4℃条件孵育过夜；反复用常温TBST液冲洗3遍后；加入Ⅱ抗室温37℃条件下置于平缓摇床摇动孵育1h；再常温TBST反复冲洗3遍[3,7]。吸干后用显色用BCIP-NBT显色剂。最后用GIS凝胶图像处理实验数据系统分析。

1.3 统计学方法

采用SPSSforWindows11.5统计软件，数据均用平均数±标准差表示，动物实验各组间的处理比较用t检验方法。

2 结果

2.1 行为学观察

正常对照组变化无明显差异。灵芝酸治疗组和癫痫模型组均发生持续多次的癫痫的痫性发作，其级别在Ⅱ～Ⅴ级，实验动物均达到癫痫的痫性点燃标准[3，7]，该实验研究的两组动物按有关文献报道达到制备癫痫模型成功。

2.2 大鼠脑组织N-cadherins和NT-4蛋白表达含量变化

通过实验检测Western-Blotting蛋白表达情况，癫痫痫性发作后N-cadherins蛋白表达与对照组蛋白表达相比较升高较明显，其表达差异具有显著性 (P<0.01) ；给予灵芝酸干预后，N-cadherins的蛋白表达有明显下降趋势，其表达差异具显著性(P<0.01) 。癫痫发作后NT-4蛋白表达比对照组蛋白表达明显升高，差异有显著性(P<0.05) ；给予灵芝酸干预后，NT-4蛋白表达比癫痫组蛋白表达明显升高，其差异具显著性(P<0.05)。见图1。

图1 N-cadherins和NT-4蛋白含量的变化(Western blotting)

*与对照组相比P<0.05;**与对照组相比P<0.01；#与癫痫模型组相比P<0.05 ；##与癫痫模型组相比P<0.01。

3 讨论

戊四氮(PTZ)诱导慢性点燃癫痫动物模型已经获得公认[9]，是一种非常经典的致痫药剂，NT-4不仅对神经元有促进存活、生长和分化作用，同时对保护脑神经元抵抗各种代谢损伤和毒素兴奋性起着决定性作用。在实验中Royo等[3，10]确认NT-4在动物外伤性中脑损伤的治疗功效，并报道NT-4能有效的抑制大量海马神经元的凋亡。证明NT-4对癫痫发作及创伤性脑损伤等有神经变性的临床常见疾病中起着至关重要的调控作用[3，11]。钙黏附素是一类介导钙离子依赖的细胞与细胞黏附的细胞表面蛋白。神经元型钙黏素做为钙黏素家族中的重要成员之一，在应用海人藻酸(KA)诱导的惊厥模型中的表达发现，N-Cadherin蛋白在存活神经元中的表达明显增高[3，11，12]。在本次实验研究中我们发现灵芝酸干预组的癫痫的痫性发作级别较癫痫模型组发作级别有所降低，其发作时间较癫痫模型组有所缩短，动物实验证明了灵芝酸干预后对癫痫的痫性发作有较好的控制和治疗效果。实验结果表明，癫痫痫性发作以后采用灵芝酸干预不但能有效抑制N-cad-herin蛋白表达含量升高，还有效的促进增强NT-4的蛋白表达含量。因此我们推测灵芝酸对癫痫发作既有预防作用，又有治疗作用。灵芝酸作为灵芝孢子的有效成份之一[13]，其实验结果与灵芝孢子对抑制N-cadherin的升高，促进NT-4的表达的实验结果相一致，但具体机制仍需进一步的研究。因此灵芝酸作为探寻低毒高效防治癫痫的临床用药开辟出最新的研究思路和实验科学依据。

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黑龙江省卫生厅课题，编号： 2011-437；2014年佳木斯大学大学生科技创新项目，编号：XSYD2014-012；2014年黑龙江省佳木斯大学大学生创新创业训练计划立项，编号：201410222026；佳木斯大学科技创新团队重点培育项目资助，编号：Cxtd-2013-04。

王芳芳(1975～)女，黑龙江佳木斯人，在读博士研究生。

王淑秋(1957～)女，黑龙江穆棱人，硕士，教授，硕士研究生导师。E-mail：wang_shuq@163.com。

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2015-03-16)