消痔灵注射液促进血管瘤内皮细胞凋亡作用的研究①

李善昌,梁显峰,姜炳华,闫 磊,宁尚波

(佳木斯大学附属第二医院口腔颌面外科，黑龙江 佳木斯 154002 )

消痔灵注射液促进血管瘤内皮细胞凋亡作用的研究①

李善昌,梁显峰,姜炳华,闫 磊,宁尚波

(佳木斯大学附属第二医院口腔颌面外科，黑龙江 佳木斯 154002 )

目的：检测不同浓度的消痔灵注射液(HemorrhoidInjection)对血管瘤内皮细胞(hemangiomaendothelialcells)凋亡的影响。方法：设立对照组和不同浓度的消痔灵注射液3个实验组，采用细胞培养MTT法 流式细胞术等方法检测不同浓度消痔灵注射液对血管瘤内皮细胞凋亡的作用的影响。结果：对照组及实验组HECS均呈现生长状态，随着药物浓度的增加及时间的延长，细胞形态呈现凋亡改变。消痔灵注射液对血管瘤内皮细胞凋亡的干预与给药剂量及处理时间呈正相关，其能使血管瘤内皮细胞停滞在G0/G1期，从而使血管瘤内皮细胞的死亡率显著增加(P<0.05)。流式分析结果表明给药后血管瘤内皮细胞凋亡率显著增加，差异显著(P<0.05)。 结论:消痔灵注射液促进血管瘤内皮细胞凋亡，其凋亡率与药物浓度密切相关。

血管瘤内皮细胞;消痔灵注射液;细胞凋亡

血管瘤(hemangioma)是婴幼儿最常见的先天性良性肿瘤，确切发病机理不明，新生儿发病率2%～3%，一岁以下儿童约为10%[1]。目前治疗血管瘤的方法主要有手术治疗、 激素药物治疗、 激光治疗、 冷冻 、介入治疗等[2],由于上述治疗方法对于血管瘤治疗的创伤过大，或者伴有严重的副作用。因此，寻找有效的治疗方法是人们关注的焦点。本实验的研究通过检测消痔灵注射液对血管瘤内皮细胞凋亡的影响作用，旨在验证消痔灵注射液在血管瘤中的作用机理，为寻找血管瘤新的治疗方法提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

人血管瘤内皮细胞株QDC397由上海口腔医学研究所提供。M199培养基(Gibco,美国)， 0.25%胰蛋白酶(Gibco公司，美国)、鼠抗人CD34单克隆抗体(CST公司，美国)，FITC荧光标记二抗 胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)(Hyclone公司，美国) 肝素。甲基噻唑基四唑(methylthiazolyltetrazolium,MTT)(Promega公司，美国)，流式细胞仪(BD公司，美国)GBB16CO2清洁型培养箱(Heraeus公司，德国)，超净工作台。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

体外培养人血管瘤内皮细胞株QDC397，采用10%胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)、1%双抗 的199培养基，在37℃，5%CO2条件下培养，培养至铺满瓶底80%后，用0.25%胰蛋白酶PBS溶液消化贴壁生长的细胞株，按1：2比例传代培养细胞。

1.2.2 免疫荧光染色鉴定人HECS的来源

将传代后的人HECS爬片后进行免疫荧光染色。4%多聚甲醛室温固定30min，10%胎牛血清37℃封闭30min后滴加适量稀cd34鼠抗人单克隆抗体(1：400)，以PBS作为一抗做阴性对照，置于湿盒中4℃过夜。次日在37℃避光孵育1h，加入FITC荧光标记二抗，避光孵育1h，PBS冲洗四遍，每遍5min。加入0.5μg/mLDAPI染色10min，用PBS洗3遍后，进行免疫荧光检测。

1.2.3MTT检测细胞增殖情况

血管瘤细胞消化后培养在96孔板，每孔加细胞1000个。同时采用10%胎牛血清的M199培养基将消痔灵注射液稀释成40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL三个浓度的实验组和空白对照组，共四组。分别于细胞接种后48h加药，然后在加药后的24、48、72h进行测定，测定前加入浓度为5mg/mL的MTT溶液20μL，37℃ 5%CO2培养箱孵育4h，之后弃去上清加入150μL的二甲基亚砜(DMSO)37℃孵育10min后，通过酶标仪测定OD490，细胞生长抑制率公式为(1-不同浓度组平均值/阴性对照组平均值)×100.00%。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

将不同浓度消痔灵注射液处理过的细胞，分为空白组(只加入培养基)实验组：培养基中分别加入含有(40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL)浓度的消痔灵注射液。接种细胞至六孔板，吸除培养液，用PBS洗涤细胞一次，加入0.025%的胰酶消化成单细胞悬液，1000rpm离心5min，弃上清。加入 300μL的裂解缓冲液(BindingBuffer)悬浮细胞。加入 5μLAnnexinV-FITC混匀后，加入 5μLPropidiumIodide，混匀； 室温、避光、反应 5～15min，在1h内，进行流式细胞仪的检测。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 HECS的鉴定

倒置相差显微镜下观察细胞形态：一种细胞疏松排列，胞膜明显，呈放射状生长，胞核较淡的长梭形细胞；另一种细胞紧密排列，细胞界限清晰，细胞膜明显，胞核较淡的不规则角形细胞。采用CD34 单克隆抗体对血管瘤内皮细胞进行免疫荧光法检测，细胞胞浆内(核周围)呈现绿色荧光，荧光较强，阳性率达90%以上。

2.3 不同浓度药物的细胞抑制率及细胞周期的影响

40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL三个浓度的消痔灵注射液分别在24、48、72h进行测定细胞抑制率结果表明消痔灵注射液对血管瘤内皮细胞凋亡的干预与给药剂量和处理时间呈现正相关。

MTT法测定消痔灵注射液对血管瘤内皮细胞具有生长抑制作用，并呈时间和剂量依赖关系，实验组与对照组比较在72h差异均有显著性意义(均P<0.05)。

表1 不同浓度消痔灵注射液对血管瘤内皮细胞的生长抑制率与阴性对照组的比较(%，n=4)

注：与阴性对照组相比，※P<0.05。

流式分析结果表明，血管瘤内皮细胞停滞在G0/G1期，从而使血管瘤内皮细胞的死亡率显著增加。(图a、b、c、d)

图a 阴性对照组调往率 图b 阴性对照组调往率

图c 阴性对照组调往率 图d 阴性对照组调往率

注：流式检测细胞凋亡率 图a示UL=5.73 %UR=6.37 %LL=85.79%LR=2.11% . 图b示UL=14.75 %UR=11.42%LL=66.62%LR=7.21% . 图c示UL=17.75%UR=11.42 %LL=66.62%LR=7.21% . 图d示UL=22.29%UR=16.23%LL=47.09%LR=14.39% .

3 讨论

消痔灵注射液(hemorrhoidinjection)是一种硬化剂，主要治疗内外痔疮，由明矾、五倍子等中药配制而成,具有较强的消赘去肿、收敛止血、消炎等作用。消痔灵注射液在临床上治疗血管瘤的实验性研究较多，但是没有明确的细胞学研究作为其细胞理论学基础。消痔灵注射液能使毛细血管及小静脉血管发生栓塞、纤维化、萎缩以达到治疗血管瘤性病变的目的，它的这种药理作用就是本课题利用此药研究诱导血管瘤内皮细胞凋亡的理论依据[3]。

Mulliken和Glowacki[4]将血管瘤病变分为血管瘤和血管畸形两大类，其分类依据是从病理学角度，及其血管瘤的临床表现、自然衍变 细胞生物学特性，及预后不同提出。此分类被国际血管异常研究协会(InternationalSocietyoftheStudyofVascularAnomalies,ISSVA)所采纳并已逐渐被临床医生广泛认同。本实验通过体外培养血管瘤内皮细胞，并应用免疫荧光法检测血管瘤内皮细胞。鼠抗人CD34单克隆抗体已被认为是鉴定血管瘤血管内皮细胞的特异性标记物[5]，通过激光显微镜观察，观察到所培养的内皮细胞的胞浆内(核周围)呈现较强绿色荧光表现。本实验使用鼠抗人CD34单克隆抗体对培养的血管瘤内皮细胞进行了免疫荧光鉴定，结果阳性表达率达90%以上，与文献报告相符，从而确定为所培养的细胞为血管瘤内皮细胞，为进一步试验提供基础。本实验采用MTT比色法对不同浓度组分别进行检测，结果显示，伴随消痔灵注射液浓度增大及作用时间的延长，血管瘤血管内皮细胞的增殖受到明显的抑制，为了进一步探讨消痔灵注射液对血管瘤血管内皮细胞的生长抑制作用，本实验进一步采用流式细胞仪对不同浓度消痔灵注射液作用后的血管瘤内皮细胞周期及细胞凋亡程度进行检测分析，结果显示消痔灵注射液中的活性成分能有效促进血管瘤内皮细胞的凋亡，其药效与剂量和作用时间呈正相关。统计结果分析显示，血管瘤内皮细胞主要被抑制在G0/G1期，有统计学意义。这为临床医生使用消痔灵注射液治疗血管瘤患者提供了科学依据。

[1]JacobsAH,WaltonRG.Theincidenceofbirthmarksintheneonate[J].Pediatrics,1976,58(2)：218-222

[2]中华口腔医学会口腔颌面外科专业委员会脉管性疾病学组.口腔颌面部血管瘤治疗指南[J].中国口腔颌面外科杂志,2011,9(1)：61-67

[3]崔超 ，张荣明. 地塞米松联合消痣灵局部注射治疗血管瘤和血管畸形疗效观察[J].中国美容医学,2011,20(4)：630-631

[4]MullikenJB,glowackiJ.Hemangiomasandwascularmalformationsininfantsandchildren:Aclassificationbasedonendothelialcharacteristics[J].PlastTeconstrSurg,1982,69:412

[5]AchauerBA,ChangCJ,VanderKamVM.Managenmentofhemangiomaofinfancy:reviewof245patients[J].Plastreconstrsurg,1997,99(5):1301-1308

Study of Xiaozhiling injection in hemangioma endothelial cell promote apoptosis tumor

LIShan-chang,LIANGXian-feng,JIANGBing-hua,YANLei,NINGShang-bo

(The Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Hospital of Stomatological Jiamusi University, Jiamusi 154002, China)

Objective:To detect different concentrations of xiaozhiling injection (Hemorrhoid Injection) of hemangioma endothelial cells (hemangioma endothelial cells) apoptosis. Method: To set up the control group and different concentrations of xiaozhiling injection three experimental group, and the methods of cell culture determined by MTT method, flow cytometry to detect different concentrations xiaozhiling influenced by injection of hemangioma endothelial cell apoptosis. Results:The control group and experimental group HECS showed growth state, with the increase of drug concentration and the extension of time, the cell morphology change present apoptosis. Xiaozhiling injection of interference from the hemangioma endothelial cell apoptosis and give medicine dose and treatment time were positively correlated.It can make the stagnation of hemangioma endothelial cells in G0/ G1phase, so that the mortality of hemangioma endothelial cells increased significantly (P<0.05).Flowanalysisresultsshowedthatthehemangiomaendothelialcellapoptosisrateincreasedsignificantlyafterthetreatment,withthesignificantdifference(P< 0.05). Conclusion: Xiaozhiling injection promotes hemangioma endothelial cell apoptosis, the apoptosis rate is closely related to the drug concentration.

hemangioma endothelial cells;Xiaozhiling injection;cell apoptosis

佳木斯大学研究生科技创新项目，编号：LM2014-044。

李善昌(1947～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，教授，主任医师，硕士研究生导师。

梁显峰(1983～)男，黑龙江佳木斯人，在读硕士研究生。E-mail:306365799@qq.com。

R543

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1008-0104(2015)04-0040-03

2015-02-28)