白花蛇舌草总黄酮对苯并(a)芘致实体瘤小鼠IL-2和IL-6的影响*

王秋兰，朱建坤，韩 涛，林 丽

甘肃中医学院，甘肃 兰州730000

白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Wild)系茜草科耳草属植物，带根全草，别名蛇舌草。味苦、甘,性寒,归心、肺、肝、大肠经。具有清热解毒、利湿、消肿镇痛、抗癌功效。近年来,对白花蛇舌草的抗肿瘤作用进行了诸多研究，对其抗肿瘤活性成分、作用机制、临床使用等各方面的研究都取得了进展［1-6］。环境中有机物质的不完全燃烧可产生大量的多环芳烃类物质(PAH)。PAH在人体内的代谢终产物是二氢二醇环氧苯并芘(BPDE)，BPDE可以与DNA形成PAH-DNA加合物，引起DNA损伤，诱导基因突变和细胞癌变，与肿瘤的形成有关［7-9］。苯并(a)芘是多环芳烃中最重要的致癌物质。PAHs可以引起机体的免疫抑制反应，表现为血清免疫学指标的改变［10］。相关报道显示［11］工人接触PAHs后有免疫抑制现象，波兰焦炉工血清 IgG和IgA明显降低，而血清lgM和lgE有增高趋势。IL-2是T细胞生长因子，能增强T细胞的杀伤活性，IL-6由单核巨噬细胞、内皮细胞及淋巴样细胞产生，是一种多效应细胞因子，可促进B细胞增生分化和分泌抗体。本研究拟观察白花蛇舌草总黄酮对IL-2和IL-6的影响，尤其是苯并(a)芘致实体瘤小鼠IL-2和IL-6的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 白花蛇舌草购于兰州安宁医药公司，经甘肃中医学院中药鉴定教研室林丽老师鉴定为茜草科耳草属白花蛇舌草干燥全草。FW200高速中药粉碎机(天津华鑫仪器厂)；SKW型数显恒温电热套(山东郓城华鲁电热仪器有限公司)；电子天平PL202-L(梅特勒-托利多上海有限公司)；HHS-4S电子恒温不锈钢水浴锅(上海宜昌仪器纱筛厂)；40目药典筛；无水乙醇；苯并(a)芘(美国Accustandard公司产品)；SPF级昆明种小鼠60只，雌雄各半，体质量(20±2)g，甘肃中医学院动物实验中心提供，实验动物合格证号：SCXK（甘）2011-0001-0001331；实验动物器械均购自兰州市医疗器械总公司；小鼠IL-2 ELISA检测试剂盒(96孔)及小鼠IL-6 ELISA检测试剂盒(96孔)（美国R&D公司）；二甲亚砜、乙醚（上海第一生化药业有限公司生产）。

1.2 实验方法

1.2.1 白花蛇舌草总黄酮的提取 将购买的药材分捡，去除泥沙杂质，用高速中药粉碎机粉碎，过40目药典筛，然后取一定量的药材至圆底烧瓶，加10倍量80%乙醇浸泡1小时后回流提取，待煮沸后至3小时，抽滤；给药渣中加6倍量80%乙醇，回流1小时，抽滤；合并滤液，弃残渣。将合并后的滤液置蒸发皿中于水浴蒸发至无醇味。称量，计算得膏率，存于样品瓶，保存于-80℃超低温冷藏柜待用。

1.2.2 动物模型制备 预实验确定造模剂量，然后取小鼠60只，雌雄各半，体质量(20±2)g。分为苯并(a)芘实验组40只和对照组20只；实验组再随机分为苯并(a)芘 20mg/kg组、苯并(a)芘10mg/kg组各20只，DMSO溶解苯并(a)芘，配置成4mg/mL溶液，然后以苯并(a)芘 20、10 mg/kg腹腔注射，1次/d，连续注射10次；对照组DMSO 100μL/只腹腔注射；2个月后，实验各组均分为白花蛇舌草总黄酮高、低剂量组，每组10只，分别给予白花蛇舌草流浸膏20 g/kg、10 g/kg灌胃，1次/d，连续给药2周。

1.3 取材与检测 给药结束，饲养两周后取材。截止取材时为止，60只小鼠，存活小鼠共56只，4只小鼠灌胃过程中死亡。乙醚麻醉小鼠，股动脉取血，分离血清，ELISA法测定血清中IL-2及IL-6。解剖小鼠，取肝、脾、肾、胰、胃肠、肺等器官，编号后福尔马林溶液固定，常规包埋，切片，HE染色,显微镜下观察。

1.4 统计学方法 数据应用SPSS 11.5统计软件进行分析，计量资料采用t检验；率的比较采用χ2检验和Fisher确切概率法检验；检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 苯并(a)芘诱发实体瘤情况 苯并(a)芘10 mg/kg组19只，发生肝癌5只，占26.3%；肝细胞核大深染，核分裂像多见，肝小叶结构紊乱，为癌前病变，共14只，占73.7%，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；未诱发胃癌，腺体结构紊乱，细胞层数增多，呈现中-重度不典型增生，为癌前病变，共13只，占68.4%，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，6只未见明显病变；未诱发肾癌，肾小管上皮细胞混浊肿胀，颗粒变性，结构疏松，部分细胞异型性明显，为癌前病变，共9只，占47.4%，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，10只未见明显病变。苯并(a)芘20 mg/kg组发生肝癌6只，占35.3%，癌前病变11只，占64.7%，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；发生胃癌7只，占41.2%；癌前病变5只，占29.4%，癌及癌前病变与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，5只未见明显异常；发生肾癌2只，占11.8%，癌前病变10只，占58.8%，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，5只未见明显异常。苯并(a)芘20mg/kg组的胃癌发生率明显高于10mg/kg组，且呈明显量效关系。实验组肺脏、胰腺均未见明显损害。

2.2 IL-2、IL-6检测

2.2.1 实验组IL-2、IL-6含量 实验组IL-2浓度均明显低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；IL-6浓度实验组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表 1。

表1 IL-2和IL-6含量

2.2.2 白花蛇舌草总黄酮不同剂量组IL-2、IL-6含量 白花蛇草总黄酮低剂量组与高剂量组比较IL-2浓度有明显差异，且高剂量组明显高于低剂量组（P＜0.05）；IL-6浓度比较无明显差异（P＞0.05），见表 2。

表2 白花蛇舌草总黄酮不同剂量组IL-2、IL-6含量

3 讨论

多环芳烃可以对生物体造成多种危害。Heudor f U等［12］在一年的时间里调查接触苯并(a)芘的儿童发现，15%的儿童肘部患过湿疹，10%的儿童患过风疹，20%儿童经常打喷嚏、流鼻涕或鼻塞，15%的儿童流过鼻血，25%的儿童感觉呼吸困难，42%的儿童经常干咳，60%的儿童易感冒。Troisi GM等［13］研究了由于石油泄漏而产生多环芳烃污染地域中的海鸥，发现它们普遍出现体温下降、脱水、体质衰弱等症状，而在它们的肝细胞中检测到多环芳烃及其代谢物，证实其受到多环芳烃的毒害。Burchiel SW等［10］通过研究发现多环芳烃可改变人类细胞中T和B淋巴细胞的功能并损害单核细胞。Jedrychoski W等［14］经过研究证实孕妇接触PAHs可能导致胎儿免疫功能的损害和增加新生儿和幼儿患呼吸道疾病的几率。Detmar J等［15］的研究表明长期接触PAHs的孕妇可能导致高流产率。本实验中，实验组IL-2浓度明显低于对照组，提示苯并(a)芘对机体的细胞免疫有明显的抑制作用。

白花蛇舌草抗肿瘤作用明显，现有研究已明确了白花蛇舌草一些具有防治肿瘤作用的化学成分及可能机制，但还不能准确地对应其可能的物质成分，可以确定有多种成分具有抗肿瘤活性。例如脱脂水提醇沉多糖可显著抑制S-180实体瘤的生长［16］；多糖可抑制 S-180肉瘤细胞生长［17］；白花蛇舌草提取物在体外对人肝癌多药耐药细胞Bel-7402有抑制作用［18］；白花蛇舌草乙醇提取物明显抑制体外培养的肿瘤细胞［19］；醇水提取后分成石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位，分别进行筛选，发现水提部位仍然具有一定的抗肿瘤作用，该部位主要具有白花蛇舌草多糖、寡糖、寡肽、对香豆酸等成分［20］。

白花蛇舌草可刺激小鼠抗体形成细胞(B细胞)的产生，促进B细胞增殖分化为浆细胞，使抗体分泌量增加，同时用药组小鼠血清IgG含量增加。白花蛇舌草可使ConA激发的T淋巴细胞增殖反应明显增强，表明白花蛇舌草对T淋巴细胞功能具有增强作用，已知T细胞是机体免疫系统赖以实现免疫调节的重要细胞，在机体特异性免疫应答中起核心作用，因此白花蛇舌草可增强机体免疫功能。

本实验中，白花蛇舌草总黄酮高剂量组IL-2浓度高于低剂量组；白花蛇舌草总黄酮低剂量组与高剂量组比较IL-6浓度无明显差异，提示白花蛇舌草总黄酮有一定的细胞免疫调节功能，可能是通过调节T细胞的功能发挥作用，而对B细胞功能及体液免疫的影响不显著。白花蛇舌草总黄酮能在一定程度上对抗化疗药物的骨髓抑制，有望成为新辅助化疗药物，有较高的临床应用价值。

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