白花蛇舌草注射液逆转人肝癌细胞BEL-7402／5-FU的多药耐药作用

廖作庄，韦丽美，徐灵源，梁 钢

（1．右江民族医学院附属医院药剂科，广西百色 533000；2．百色市人民医院人事科，广西百色 533000；3．广西医科大学药学院药理学教研室，广西南宁 530021）

白花蛇舌草（Hedyotic diffusa）别名蛇舌草、蛇舌癀、蛇针草等，为茜草科耳草属草本植物，具有清热解毒、活血散结、利水消肿的功效［1］，主要分布在中国南方的广西、广东、云南等省以及尼泊尔、日本等国。近年来研究发现，白花蛇舌草对多种肿瘤具有一定的抑制杀伤作用，包括肺癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、白血病、人脑胶质细胞瘤等［2］，但是关于其逆转肿瘤多药耐药（multi-drug resistance，MDR）的作用鲜有报道。本实验研究白花蛇舌草注射液逆转人肝癌细胞BEL-7402／5-FU的作用，通过新型抗肿瘤靶点酪氨酸激酶的变化，探讨其逆转人肝癌细胞MDR作用机制，进一步研究开发白花蛇舌草的抗肿瘤药用价值。

1 材料与方法

1．1 细胞株 人肝癌MDR细胞株BEL-7402／5-FU购自南京凯基生物技术有限公司。

1．2 药品及试剂 白花蛇舌草注射液，安徽凤阳科苑药业有限公司；胰蛋白酶，美国Amersco公司；5-氟尿嘧啶（5-FU）、胎牛血清，美国Gibco公司；RPMI 1640培养液，美国Gibco公司；二甲基亚砜（DMSO），广州市新港化工有限公司；四甲基偶氮唑盐（MTT），美国Amersco公司；细胞凋亡检测试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司

1．3 仪器设备 超净工作台，苏州净化设备厂；倒置光学显微镜，日本Olympus公司；二氧化碳孵育箱MAel311，美国Thermo Forma公司；酶联免疫检测仪MAel-450，美国Bio-Rad公司；离心机TGL-16C，上海安亭科学仪器厂；流式细胞仪FACSCaLibur，美国BECTON DICKINSON公司；4℃低温高速离心机，Biotech公司。

1．4 方法

1．4．1 细胞培养 BEL-7402／5-FU置培养箱中，在37℃、50mL／L CO2充分湿化条件下用含100mL／L胎牛血清的RPMI 1640培养液进行培养。在5-FU质量浓度为80μg／mL时，人肝癌MDR细胞株BEL-740／5-FU生长良好，所以在培养时加80μg／mL的5-FU，以维持细胞多药耐药性。停药1周，取对数生长期细胞用于实验。

1．4．2 MTT法测定白花蛇舌草注射液对BEL-7402／5-FU的毒性作用 取对数生长期单细胞悬液（约1×105／mL），接种于96孔板中，每孔100μL，使细胞密度为5×104／mL，培养过夜细胞贴壁后，按梯度加入5个不同体积浓度的药物，并补RPMI 1640培养液至200μL，空白对照组加RPMI 1640培养液100μL，重复4个复孔。待细胞继续孵育24h后，加入20μL MTT（5g／L）孵育4h，弃去培养液，每孔加入二甲基亚砜150μL，酶联免疫检测仪单波长490 nm测吸光度值（A）。平均吸光度值以均数±标准差（±s）表示，计算细胞生长抑制率（IR）。细胞生长抑制率（IR）＝（对照组A值-药物组A值）／对照组A值×100%。求出10%的细胞生长抑制所需浓度（IC10）。

1．4．3 MTT法测定白花蛇舌草注射液对肝癌细胞耐药性的逆转作用 选取对BEL-7402／5-FU细胞抑制率小于10%的药物浓度进行实验。实验分2组：5-FU组和白花蛇舌草＋5-FU组。按前述方法进行MTT实验，计算各组IR，应用LOGIT软件求出IC50，逆转耐药倍数＝5-FU组IC50／（白花蛇舌草＋5-FU）组IC50。

1．4．4 流式细胞术检测细胞凋亡情况 BEL-7402／5-FU细胞分3组：空白组、5-FU组和白花蛇舌草注射液＋5-FU组。药物作用24h后，收集细胞并用PBS在1 000r／min离心5min，洗涤2次，收集1～5×105细胞，加入500μL的Binding Buffer以悬浮细胞，再加入5μL Annexin V-FITC混合均匀，最后加入5μL Propidium Iaide（PI）。将细胞轻轻震荡混匀重悬，流式细胞仪检测分析。如此重复3次，并计算3次的平均凋亡率（%）。

1．4．5 ELISA双抗体一步夹心法测定酪氨酸蛋白激酶含量 取对数生长期BEL-7402／5-FU细胞，RPMI 1640培养液调整细胞密度为3×105／mL接种于培养皿。分别设空白对照组、5-FU组、白花蛇舌草组和白花蛇舌草＋5-FU组。作用24h后，PBS洗涤2次，加入用冰预冷的三去污剂裂解缓冲液RIPA（含100μg／mL的PMSF、1μg／mL的Aprotinin和2μg／mL的Leupetin）150mL裂解细胞，与细胞充分接触3min后，用细胞刮刀把细胞轻轻刮下，转移至冰预冷的EP管中（1．5mL）。4℃、1 000g离心10min，收集上清液作为总蛋白提取物。分别设空白孔、标准品孔、待测样本孔。标准品孔中加入50μL不同浓度的标准品，样品孔加10μL待测样本，再加40μL样品稀释液，空白孔不加。采用ELISA双抗体一步夹心法测定酪氨酸蛋白激酶含量。

2 结 果

2．1 药物对肝癌细胞的毒性作用 白花蛇舌草注射液对BEL-7402／5-FU细胞的毒性作用见表1。白花蛇舌草注射液浓度在10μL／mL以上时对细胞生长有抑制作用，浓度越高，抑制作用越明显，不同浓度处理组与空白对照组相比差异有统计学意义（P＜0．001）。计算白花蛇舌草注射液对BEL7402／5-FU细胞的IC50为182．6μL／mL，IC10为8．38μL／mL。

2．2 药物对BEL-7402／5-FU细胞MDR的逆转作用药物对细胞IC10以下浓度可认为该药在这一浓度下无毒性作用，因此选用非细胞毒性剂量6μL／mL白花蛇舌草注射液联合5-FU（浓度分别为100、200、400、800、1 600μmol／L）进行多药耐药逆转实验，结果见表2。5-FU组IC50为1 071．6μmol／L，白花蛇舌草＋5-FU组IC50为636．5μmol／L，两组不同浓度的抑制率差异有统计学意义。计算其对BEL-7402／5-FU细胞株逆转倍数为1．68倍。

表1 白花蛇舌草注射液对BEL7402／5-FU的毒性作用Tab．1 The toxicity of Hedyotic diffusa injection to BEL-7402／5-FU cells

表2 MTT法检测两组药物对BEL7402／5-FU的抑制率Tab．2 Inhibition rate of two groups of drugs on BEL7402／5-FU cells detected by MTT assay（±s，%）

表2 MTT法检测两组药物对BEL7402／5-FU的抑制率Tab．2 Inhibition rate of two groups of drugs on BEL7402／5-FU cells detected by MTT assay（±s，%）

与5-FU组相比，＊P＜0．01。

5-FU组 白花蛇舌草＋5-FU组10．4±2．52 15．21±3．12＊23．1±3．82 30．30±2．70＊40．4±1．57 43．30±1．84＊44．5±4．74 52．80±1．97＊52．2±4．67 67．80±2．10＊

2．3 流式细胞仪检测肝癌细胞的凋亡情况 空白组、5-FU 组（400μmol／L）和白花蛇舌草注射液6μL／mL＋5-FU（400μmol／L）组细胞凋亡率分别为0．79%、23．8%、30．6%，两组细胞凋亡率均高于空白对照组，联合用药组细胞凋亡率与5-FU组相比，差异有统计学意义（P＜0．01）。

2．4 酪氨酸激酶含量的测定结果 绘制酪氨酸激酶含量（A450）-A值标准曲线见图1。标准曲线方程为：y＝503．22x-64．475，R2＝0．991 3。将测量得到的各组A值（实际测量A值-空白孔A值）代入标准曲线中计算，再乘以稀释倍数为5倍，可得到各组药物作用后酪氨酸激酶含量（表3）。白花蛇舌草组和白花蛇舌草＋5-FU组与空白对照组、5-FU组相比，差异有统计学意义（P＜0．01）。

3 讨 论

图1 酪氨酸激酶含量（A450）-A值标准曲线图Fig．1 Content of tyrosine kinase（A450）-A standard curve

表3 各组药物作用后酪氨酸激酶含量的比较Tab．3 Comparison of tyrosine kinase content after drug action in each group

肝癌化疗效果不理想，对化疗药的敏感性差，一方面是许多肝癌细胞株具有天然耐药性，另一方面是化疗过程中药物诱导产生多药耐药。多药耐药的机制十分复杂，寻找具有多靶点效应的MDR逆转剂是解决这一问题的关键。分子靶向的酪氨酸激酶抑制剂在肿瘤治疗方面具有高选择性，副作用较小，已经成为近年来抗癌药物研究的新热点和发展趋势。酪氨酸激酶抑制剂作为肿瘤MDR逆转剂已经得到证实，并成功应用于临床治疗［3］。

白花蛇舌草注射液主药为白花蛇舌草，辅料为亚硫酸氢钠和聚山梨酯80。白花蛇舌草是常用的中草药之一，近几年研究发现其抗肿瘤作用十分广泛，作用机制主要是通过调控Ras、C-myc、Bcl-2等抑癌基因表达而实现［4-6］。白花蛇舌草逆转肿瘤多药耐药性的研究较少。有学者报道，白花蛇舌草注射液能逆转K562／ADM细胞的多药耐药性，能下调K562／ADM细胞Bcl-2基因的表达［7］。此后凌志扬等［8］应用白花蛇舌草联合化疗药物进行临床抗癌应用，发现可提高癌症治疗效果，较单独应用化疗药更能改善患者生存质量。

本实验研究白花蛇舌草注射液对人肝癌BEL7402／5-FU细胞的MDR的逆转作用，发现其能下调人肝癌BEL7402／5-FU细胞酪氨酸含量，促进细胞凋亡，其作用机制可能与下调酪氨酸激酶含量有关，很有希望开发成为具有很好应用前景的中药MDR逆转剂。酪氨酸激酶是新型的抗肿瘤药物靶点，本实验验证了酪氨酸激酶抑制剂可作为肿瘤多药耐药逆转剂，对于从中草药中筛选肿瘤多药耐药逆转剂具有很好的参考价值。但是肝癌MDR机制涉及靶点多，目前已得到证实的相关靶点包括P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白（MRP）、乳腺癌耐药蛋白（BCRP）、肺耐药相关蛋白（LRP）、Bcl-2基因、survivin基因、P53基因、Clusterin、DNA拓扑异构酶、谷胧甘肽-S-转移酶、蛋白激酶C等［9］。中药MDR逆转剂常常是多靶点多途径同时作用，需进一步加强白花蛇舌草对肝癌MDR作用靶点的检测，以便深入探讨其作用机制。另外，中药成分复杂，白花蛇舌草逆转肝癌MDR作用的有效成分和机制还需要进一步研究。

［1］中华本草编委会．中华本草［M］．第6册．上海：上海科学技术出版社，1999．

［2］邓红艳，高宝安，陈世雄．白花蛇舌草抗肿瘤的实验研究进展［J］．现代中西医结合杂志，2009，18（16）：1947-1950．

［3］黄鹤飞，王燕燕，周志勇．酪氨酸激酶抑制剂逆转肿瘤多药耐药的研究进展［J］．中国药房，2013，24（2）：167-170．

［4］WANG JH，SHU LH，YANG LL，et al．2-Hydroxy-3-methylan-thraquinone from Hedyotis diffusa WILLD induces apoptosis via alteration of Fas／FasL and activation of caspase-8 in human leukemic THP-1 cells［J］．Arch Med Res，2011，42（7）：577-583．

［5］LIN J，WEI L，XU W，et al．Effect of Hedyotis Diffusa Wild extract on tumor angiogenesis［J］．Mol Med Report，2011，4（6）：1283-1288．

［6］沈楚云，林圣云，戴铁颖，等．白花蛇舌草诱导骨髓8226细胞凋亡的研究［J］．深圳中西医结合杂志，2012，22（1）：4-7．

［7］黄鹤飞，王燕燕，周志勇．酪氨酸激酶抑制剂逆转肿瘤多药耐药的研究进展［J］．中国药房，2013，24（2）：167-170．

［8］凌志扬，房玉良．白花蛇舌草联合化疗对癌症治疗的Meta分析［J］．中国当代医药，2013，20（30）：4-6．

［9］陈文军，李波．肝癌多药耐药机制的研究进展［J］．西南军医，2013，15（1）：80-82．