sCD14在痛风性关节炎患者炎症反应中的变化及其意义

党万太，王 婧，谢文光，周京国

（1．川北医学院附属医院风湿免疫研究所，四川南充 637000；2．成都中医药大学临床医学院，四川成都 610075；3．甘肃中医学院，甘肃兰州 733005）

痛风（gout）是一种单钠尿酸盐（monosodium urate，MSU）沉积所致的晶体相关性关节病，与嘌呤代谢紊乱及（或）尿酸排泄减少所致的高尿酸血症直接相关，属于代谢性风湿病范畴［1］。研究发现，除代谢因素外，免疫与炎症也参与痛风的发病，尤其是固有免疫（innate immunity）在痛风的急性炎症发生发展过程中发挥着重要作用［2］。CD14即LPS（lipopolysacharide）受体，最初是一种存在于巨噬细胞、单核细胞等细胞表面的白细胞分化抗原［3］。CD14属于固有免疫反应系统的模式识别受体，在体内以2种形式存在：膜CD14（membrane CD14，mCD14）和可溶性CD14（sCD14）。sCD14是CD14分子在体内的主要存在形式，是调控LPS作用于非髓样细胞的重要介质。血浆中的sCD14能特异性识别、结合LPS或LPS／脂多糖结合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）复合物，递呈给 Toll样受体（Toll like receptors，TLRs），TLR通过IL-1信号转导通路中的信号分子髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、端粒重复序列结合蛋白（telomeric-repeat binding factor 6，TRF6）等间的相互作用，激活核因子κB（nuclear factor-kappa，NF-κB）信号转导通路，引起多种炎性细胞因子的合成与分泌，最终导致过度的全身炎症反应及组织器官损伤［4］。已有研究显示，sCD14在炎性肠病等多种疾病中发挥重要的作用［5-6］。然而，sCD14在痛风性关节炎患者炎症反应中的作用仍不清楚。本研究通过qRT-PCR法检测GA患者PBMCs的CD14mRNA表达水平，并结合相关实验及临床指标进行分析，探讨sCD14在痛风性关节炎患者炎症反应中的变化及其意义。

1 对象与方法

1．1 临床资料 应用1977年美国风湿病协会（ACR）痛风诊断标准［6］，排除肾脏、心血管、血液疾病引起的继发性痛风，排除合并感染或自身免疫性疾病者。收集2012年9月至2013年8月川北医学院附属医院风湿门诊和住院的31例急性痛风性炎节炎（acute gouty arthritis，AGA）患者、23例非 AGA（non-acute gouty arthritis，NAGA）患者，均为男性，年龄22～79（44±13）岁，病程1～21（8±4）年。健康对照（healthy control，HC）组为20名同期在川北医学院附属医院体检的健康男性，年龄24～62（40±9）岁，入选者实验室指标均无异常且无心血管系统疾病、糖尿病、肝脏疾病及痛风等病史，并排除感染及自身免疫性疾病。各组人群年龄差异无统计学意义。该实验通过当地伦理委员会的同意与支持，所有参与者均签订知情同意书。

1．2 主要试剂与仪器 PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ（日本 TaKaRa公司），IL-1β（北京四正柏生物科技有限公司），TNF-αELISA Kit试剂盒（博士德生物工程有限公司），Quantikine®ELISA Human sCD14（R＆D Systems USA），Beckman-Coulter原装CRP试剂（Beckman-Coulter公司），BECKMAN特种蛋白分析仪（IMMAGE800，BECKMAN COULTER，USA），7900实时PCR仪（ABI公司，USA）。

1．3 实时荧光定量PCR检测CD14mRNA的表达变化 实时荧光定量PCR检测的基因引物设计依据GenBank中人肌动蛋白（β-actin）、CD14，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。β-actin上游引物：5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACAG-3′，下 游 引 物：5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′，片段大小120bp；CD14上游引物：5′-TGAACTCCCTCAATCTGTCGT-3′，下 游 引 物：5′-CCCGTCCAGTGTCAGGTTAT-3′，片段大小152bp。

取外周静脉血2．5mL，用肝素钠抗凝。用人淋巴细胞分离液（Ficoll）无菌分离PBMCs，严格按照说明书操作提取PBMCs的总RNA，并进行电泳检测RNA完整性。cDNA的合成严格按照逆转录试剂盒说明书操作，条件为37℃15min，85℃5s终止反应。将逆转录的cDNA在ABI 7900实时PCR仪上进行检测，20μL的反应体系：SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ10μL，ROX Reference DyeⅡ0．4μL，上、下游引物各（10μmol／L）0．8μL，灭菌蒸馏水6μL，反应条件为：95℃10min，95℃15s，60℃1min，共40个循环。以2-△△Ct值进行统计分析目的基因mRNA表达水平。

1．4 ELISA检测血清sCD14、IL-1β、TNF-α、IL-6 ELISA Kit检测严格按照操作说明进行，各孔用酶标仪在450nm测定吸光度值，用试剂盒标准品制作标准曲线，根据样品的吸光度值在坐标上找出对应的浓度，样品最终浓度＝所测浓度×稀释倍数。

1．5 收集临床实验指标及检测方法 所有受试者禁食12h，于清晨采集肘静脉血，用XE-5000全自动血液分析仪检测血常规，包括白细胞计数（white blood count，WBC）、嗜中性粒细胞绝对值（granulocyte，GR）、淋巴细胞绝对值（lymphocyte，LY）、单核细胞绝对值（monocyte，MO）；用日立7600-020全自动生化分析仪检测血尿酸（uric acid，UA），血清CRP检测采用免疫比浊法。

1．6 统计学分析 采用SPSS 19．0统计软件进行统计分析，各组实验数据采用±s表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）（各组间数据若不符合正态分布，采用秩变换进行转换），组间两两比较采用最小显著差数法（LSD），各组间的相关分析采用Spearman相关分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 各组PBMCs的CD14mRNA表达 各组PBMCs的RNA提取效果良好（图1A）。AGA组患者PBMCs的CD14mRNA表达量高于HC组，差异有统计学意义（P＜0．05），NAGA组表达与HC组相比较，差异无统计学意义（P＞0．05，图1B、图1C）。

图1 各组PBMCs的CD14mRNA表达Fig．1 Expression of CD14mRNA in PBMCs in gouty arthritis

2．2 各组血浆sCD14、CRP、IL-1β、TNF-α蛋白的表达AGA组血浆sCD14蛋白水平高于HC和NAGA组，但NAGA组低于HC组，差异均有统计学意义（分别P＜0．01，P＜0．05，图2A）；AGA组CRP蛋白表达高于HC与NAGA组，差异有统计学意义（P＜0．01，图2B）；AGA、NAGA组血浆IL-1β、TNF-α蛋白表达均高于HC组，且AGA组IL-1β蛋白表达显著高于NAGA组，差异均有统计学意义（P均＜0．01，图2C）。

2．3 各临床指标的比较 AGA组和NAGA组WBC均高于HC组，差异均有统计学意义（分别P＜0．01，P＜0．05，图3A）；AGA组GR、MO均高于 HC组，AGA组患者MO高于NAGA组，差异均有统计学意义（P均＜0．05，图3A）；AGA与NAGA组UA均高于HC组，差异有统计学意义（P＜0．01，图3B）；AGA与NAGA组LY与HC组相比较，差异均无统计学意义（P＞0．05）。

2．4 CD14mRNA表达与其临床实验指标的相关性AGA组PBMCs的CD14mRNA表达与IL-1β呈正相关（rs＝0．362，P＝0．045），与 WBC、GR、LY、MO、UA、CRP、TNF-α均未见相关性（P＞0．05）；NAGA与 HC组PBMCs的 CD14mRNA 表达与 WBC、GR、LY、MO、CRP、IL-1β、TNF-α均未见相关性（P＞0．05）。

图2 各组血浆sCD14（A）、CRP（B）和IL-1β、TNF-α（C）表达Fig．2 The expressions of sCD14（A），CRP（B），IL-1βand TNF-α（C）in the plasma of gouty arthritis patients（±s）

图3 各组血常规与血尿酸检测指标的比较Fig．3 Comparison of blood routine（A）and UA（B）in gouty arthritis patients（±s）

2．5 血浆sCD14蛋白表达与其临床实验指标的相关性 NAGA组血浆sCD14蛋白表达与GR呈正相关（rs＝0．397，P＝0．030）；AGA 与 HC 组血浆sCD14蛋白表达与 WBC、GR、LY、MO、UA、CRP、IL-1β、TNF-α均未见相关性（P＞0．05）；NAGA组血浆sCD14蛋白表达与 WBC、LY、MO、UA、CRP、IL-1β、TNF-α均未见相关性（P＞0．05）。

3 讨 论

近年来，痛风的发病率呈明显增高的趋势，已引起了医学界的高度重视［7］，有研究表明炎症与免疫在痛风发病过程中发挥重要作用［2］。研究表明，MSU晶体主要通过识别细胞表面受体而激活细胞，启动炎症反应［8］。固有免疫的 Toll样受体2（Toll-like receptor 2，TLR2）与 Toll样受体4（Toll-like receptor4，TLR4）可协助MSU晶体识别并激活巨噬细胞［9］。MSU 晶体可能通过激活 TLRs，或 CD16、CD14等使TLRs激活介导炎症反应［10］。研究已证实，痛风患者外周血IL-1β明显升高［11］，IL-1β通过与IL-1受体结合激活IL-1信号通路和MyD88依赖的NF-κB信号转导通路，引起大量的IL-1β、TNF-α、IL-8等促炎因子表达，产生炎症级联放大效应［12］。本研究结果显示，GA患者急性期PBMCs的CD14 mRNA表达量显著高于健康对照组，而GA患者非急性期较健康对照差异无统计学意义；进一步检测血浆sCD14蛋白表达，结果显示GA患者急性期表达显著高于健康对照与非急性期组。这提示CD14在痛风的急性炎症反应中可能发挥重要调控作用。已知sCD14是2级急性蛋白（LBP是1级急性蛋白），IL-1β可抑制sCD14的表达，而IL-6则促进其表达［13］，且有研究显示sCD14是体内固有的LPS和TNF-α的拮抗剂［14］。本研究发现，GA患者急性与非急性期IL-1β、TNF-α表达均显著高于健康对照组，提示sCD14在痛风的炎症反应中可能发挥双向调控作用，其机制可能与sCD14对PBMCs的双重调节效应相关［15］，该机制同时可能与痛风炎症反应的自限性相关［16］。

本研究检测并分析GA患者 WBC、GR、MO、UA，结果显示，除GA患者非急性期GR与健康对照相比较差异无统计学意义外，GA患者急性期的WBC、GR、MO、UA均显著高于健康对照组，且GA非急性期组MO显著低于急性期组，表明在GA患者的病变过程中炎症反应较为显著。值得注意的是，本研究对实验相关指标进行相关性分析后发现，AGA患者PBMCs的CD14mRNA表达与IL-1β呈正相关，AGA患者血浆sCD14表达与NAGA患者GR呈正相关，提示CD14可能参与GA患者炎症的发生并发挥重要的调控作用，其机制有待进一步研究。

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