DHA联合5-FU对人胃癌细胞增殖的抑制及线粒体呼吸链膜蛋白复合体的表达变化

王曙逢，赵志浩，刘竹君，高 琨，李幼芬

（西安交通大学：1．医学部第一附属医院普通外科，陕西西安 710061；2．生命科学与技术学院，陕西西安 710049）

进展期胃癌手术后，以5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）为核心药物的辅助化疗虽可使患者生存确切受益［1-3］，但是5-FU的毒副作用和机体的耐药性使疗效受限。此外营养风险筛查发现超过50%的胃癌患者均伴随不同程度的营养不良和营养风险［4］，进而使辅助化疗的风险增加。肿瘤营养学专家推荐富含特殊免疫营养素的配方进行营养支持［5］。因此，寻找一种新型治疗方案，既能改善患者免疫营养状态，又能对化疗药物有增敏作用，则具有重要的临床实践意义。鱼油来源的免疫营养素ω-3多不饱和脂肪酸主要包括二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），它不仅作为能源底物氧化供能，而且亦可调控机体的免疫功能。更为重要的是，有证据显示DHA不仅增强结肠癌细胞对5-FU的敏感性，而且亦可以减轻其毒副作用［6-7］，然而，关于DHA与胃癌关系的研究仍然有限。因此，本研究拟通过体外细胞培养试验，从细胞线粒体能量代谢和细胞周期的角度，探讨DHA联合5-FU对人胃癌细胞株AGS的协同作用，为胃癌的临床综合治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料与试剂 人胃腺癌细胞株AGS由西安交通大学生命科学与技术学院提供。新生胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司。RPMI 1640培养基购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司。DHA，分子式为C22H32O2，相对分子质量为328．5，纯度为99%，购自美国Sigma公司。5-FU购自上海旭东海普药业有限公司。线粒体呼吸链膜蛋白复合物抗体购自美国Invitrogen公司，四甲基偶氮唑蓝（MTT）染色液购自北京赛驰生物科技有限公司。

1．2 细胞培养 人胃癌细胞株AGS常规培养于含有100mL／L胎牛血清并添加100IU／mL青霉素和100IU／mL链霉素的RPMI 1640培养基中，置于50 mL／L CO2和37℃的培养箱中贴壁培养。待细胞铺满瓶底后，用适量2．5g／L胰酶消化细胞传代培养，取对数生长期的细胞进行实验。

1．3 检测DHA和5-FU对细胞增殖的影响并确定合适的实验浓度 收集对数生长期的AGS细胞，用2．5g／L胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×104／mL，接种于96孔培养板上，200μL／孔，加入培养基100μL，置于37℃、50mL／L CO2的培养箱中贴壁培养。实验组细胞分别使用含DHA、5-FU或DHA＋5-FU的培养液。DHA终质量浓度分别为7．5、15、22．5、30、37．5、45μg／mL，5-FU终质量浓度分别为1．562 5、3．125、6．25、12．5、25、50μg／mL，DHA＋5-FU终质量浓度分别为7．5＋1．562 5、15＋3．125、22．5＋6．25、30＋12．5、37．5＋25、45＋50μg／mL。每个浓度设置5个重复孔，对照组细胞加入等体积无药物培养液。以无血清培养液作空白调零，平行培养24、48h后，各孔加入5g／L的 MTT 20μL，继续培养4h后，吸尽孔内液体，各孔加入150μL DMSO，震荡10min后，酶联免疫检测仪测570nm波长处每孔吸光度（A）值，采用公式计算细胞增殖抑制率。抑制率＝1-（实验组平均A值／对照组平均A值）×100%。实验重复3次，结果取平均值。

根据中效原理，中效浓度为药物抑制作用达50%时的浓度，即IC50值。中效方程为抑制率／存活率＝（D／Dm）m，D是药物浓度，Dm是IC50值。方程两边取对数得直线方程Y＝mX＋a，其中Y＝log抑制率／存活率，X＝logD，m为斜率，a是截距，Dm可由公式logDm＝-a／m计算得出。两种药物联合使用效果的判定根据Chou-Talalay联合指数法的量效公式计算两药合用在各种效应时的合用指数（combination index，CI），当CI＜1时，两药合用效应为协同；当CI＝1时，两药合用效应为相加；当CI＞1时，两药合用效应为拮抗。

1．4 检测细胞周期的变化 参考不同浓度梯度DHA、5-FU和DHA＋5-FU分别作用AGS细胞由中效方程求得的IC50，选择DHA和5-FU适宜的作用浓度分别30μg／mL和12．5μg／mL。实验分为：对照组（无干预药物）；DHA（30μg／mL）组；5-FU 组（12．5μg／mL）；DHA＋5-FU（30＋12．5μg／mL）组。分别处理48h。

收集各组细胞，制备单细胞悬液。1 000r／min离心5min，PBS洗涤细胞，重复3次。用200μL PBS重悬细胞至15mL的试管中，以边滴加边振荡的方式缓慢加入5mL 700mL／L无水乙醇。细胞至少在4℃固定1h。以1 000r／min或稍高的转速用PBS洗涤3次。加入500μL的碘化丙啶染液（含RNase），避光染色30min后，加3mL PBS振荡混匀后以300目尼龙网滤过，流式细胞仪（FACSC albur型）进行细胞周期分析，每份标本累计分析20 000个细胞。所得数据流式细胞仪自备软件处理。

1．5 Western blot检测细胞线粒体呼吸链膜蛋白复合体 收集各组（同1．4）处理不同时间段的AGS细胞，裂解并提取线粒体呼吸链膜蛋白复合体，BSA测定蛋白含量，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白后转膜，50g／L脱脂牛奶封闭后进行免疫反应。一抗分别为1∶500稀释的线粒体呼吸链膜蛋白复合体抗体，二抗为抗线粒体呼吸链膜蛋白复合体抗体IgG 1∶500稀释，按操作说明书染色。使用扫描仪扫描并保存图像。用Quantity One 4．6软件测得线粒体复合体蛋白条带的灰度值，进行统计学分析。

1．6 统计学方法 计量资料采用均数±标准差表示，应用SPSS 19．0统计软件进行统计学分析，采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD法，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 药物对AGS细胞生长增殖的影响 与对照组比较，不同浓度梯度的DHA、5-FU单用或合用均对AGS细胞增殖有抑制作用。DHA和5-FU单用或联用的抑制效应随着药物浓度梯度和作用时间增加而增强（P＜0．05，表1）。根据中效方程计算5-FU单用时IC50为45．9μg／mL（24h）、16．86μg／mL（48h）；DHA单用 时IC50 为 51．6μg／mL（24h）、34．82μg／mL（48h）；二者合用时5-FU 的IC50降至12．9μg／mL（24h）、7．84μg／mL（48h），减少了3．56～2．15倍。说明DHA可显著增强5-FU对AGS细胞增殖的抑制效应，减少5-FU的用量，CI＜1二者呈现协同作用。

2．2 药物对AGS细胞周期的影响 与对照组比较，药物处理48h后，DHA、5-FU组均可以使AGS细胞的DNA合成前期（G0／Gl期）细胞比例明显增加，DNA合成期（S期）细胞比例明显减少，说明DHA、5-FU均能阻滞AGS细胞进入S期，且阻滞细胞于G0／G1期，二者联合干预产生的G0／G1期阻滞作用较对照组、DHA组、5-FU组所引起的G0／G1阻滞作用更显著（P＜0．05，表2）。

表1 DHA、5-FU对AGS增殖的抑制作用Tab．1 The inhibitory effect of DHA and 5-FU on the proliferation of AGS cell lines

表2 DHA、5-FU干预AGS细胞周期的分布Tab．2 The effect of DHA and 5-FU on cell cycle of AGS cell lines（±s，%）

表2 DHA、5-FU干预AGS细胞周期的分布Tab．2 The effect of DHA and 5-FU on cell cycle of AGS cell lines（±s，%）

与对照组比较，＊P＜0．05。

组别 G0～G1期 S～G2期对照组42．03±1．34 57．97±3．14 DHA组 59．05±6．41＊ 40．94±0．47＊5-FU组 63．39±6．83＊ 36．61±2．75＊DHA＋5-FU组 70．79±2．63＊ 29．21±0．82＊F值19．57 49．15

2．3 各组AGS细胞线粒体呼吸链膜蛋白复合物的表达变化 与对照组比较，单用DHA、5-FU干预48h均可使AGS细胞线粒体呼吸链膜蛋白复合体表达灰度值显著下降，二者联合干预其表达灰度值下降更明显（P＜0．05，表3、图1）。

表3 DHA、5-FU干预AGS细胞线粒体呼吸链膜蛋白复合体表达的灰度值Tab．3 The effect of DHA and 5-FU on the expression of mitochondrial respiratory membrane protein complex in AGS cells

图1 DHA、5-FU干预AGS细胞线粒体呼吸链膜蛋白复合物表达Fig．1 The effect of DHA and 5-FU onthe expression of mitochondrial respiratory membrane protein complex in AGS cells

3 讨 论

ω-3多不饱和脂肪酸是参与细胞单位膜磷脂构成的重要结构脂肪酸，主要包括DHA和EPA。人体内不能合成此类机体必需脂肪酸，主要依靠外源性摄入。除作为底物生物氧化提供能量之外，它还具有广泛的生理活性，例如维持细胞膜形态结构和调节细胞内信号通路；调节细胞膜流动性和通透性，影响膜磷脂双分子层中蛋白质的构象和功能发挥［8-9｝。然而，近年来ω-3多不饱和脂肪酸与恶性肿瘤发生发展的关系引人瞩目。研究发现，ω-3多不饱和脂肪酸可抑制结肠癌的发生和进展［10-11］，但其对于人胃腺癌细胞影响的相关研究较少。LEE、SHENG和ZHUO等［12-14］的研究分别表明DHA可诱导胃癌细胞凋亡，发挥抗肿瘤的效应。但是这些研究中DHA的浓度高达50～150μmol／L，180～200μmol／L，明显高于本研究中使用的浓度。对于体外药物联合研究，很有必要清楚每种药物的IC50值，这样有利于研究药物浓度的选择。因此本研究通过不同浓度梯度确定了DHA和5-FU的IC50。实验结果显示，DHA和5-FU单独干预或联合干预分别对AGS细胞的生长增殖均有明显的抑制效应，该作用随着药物浓度梯度和作用时间增加而增强，呈现时间-剂量依赖方式，这与文献报道一致［15］。根据中效方程计算5-FU单用时IC50为45．9μg／mL（24h）、16．86μg／mL（48h）；DHA单用时IC50为51．6μg／mL（24h）、34．82μg／mL（48h）；而二者合用作用AGS细胞时，5-FU的IC50降至12．9 μg／mL（24h）、7．84μg／mL（48h），减少了3．56～2．15倍。说明二者合用时，DHA能显著增强5-FU对AGS细胞生长增殖的抑制作用，并能减少5-FU的用量，DHA和5-FU合用的CI＜1，两种药物联合呈现协同作用。

恶性肿瘤细胞重要特征之一是细胞周期调控异常。有研究证实DHA可减少肝癌细胞在S期和G2期的数量分布，抑制细胞周期进程从而达到抗癌作用［16］。5-FU是一种抗代谢的抗癌药物，能通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断尿嘧啶脱氧核苷酸转变为胸腺嘧啶脱氧核苷酸，从而抑制DNA和RNA的生物合成，作为细胞周期特异性药物，主要作用于S期。本实验流式细胞仪细胞周期分析结果显示，单用DHA、5-FU分别干预之后，AGS细胞周期分布改变表现为G0／G1期细胞明显增多，而进入S期的细胞比例明显减少，两药联合干预产生的G0／G1期阻滞作用更加显著。这提示5-FU和DHA共同对AGS细胞的G0／G1期阻滞作用可能是二者具有协同作用的机制之一。

线粒体是细胞进行有氧氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）、能量代谢等生理过程的关键场所。线粒体内膜上存在5个重要的呼吸链膜蛋白功能复合体：NADH-泛醌氧化还原酶复合体、琥珀酸-泛醌氧化还原酶复合体、泛醌-细胞色素C还原酶复合体、细胞色素C氧化酶复合体、ATP合成酶复合体。目前认为，细胞通过2条氧化呼吸链生成ATP，即NADH→复合体→CoQ→复合体→复合体→复合体→ATP和琥珀酸→复合体→CoQ→复合体→复合体→复合体→ATP。

正常细胞能量代谢的特点是使用葡萄糖在线粒体内进行OXPHOS，然而肿瘤细胞能量代谢的显著特点表现在活跃地摄取葡萄糖，即使在氧供应充足的条件下，它仍在胞质以低效率的糖酵解方式获取能量，称之为有氧糖酵解，即 Warburg效应［17］。该效应提出后，人们曾认为肿瘤细胞线粒体的功能受损丧失了OXPHOS的能力，肿瘤细胞能量供应中有氧糖酵解取代OXPHOS占优势。然而，近年来的研究发现事实并非如此，线粒体绝非是肿瘤细胞能量代谢的旁观者［18］，越来越多的证据显示，肿瘤细胞中的线粒体并没有丧失功能，线粒体仍然是肿瘤细胞能量代谢的中心和众多生物合成途径的枢纽所在［19］。研究发现有氧糖酵解对肿瘤细胞总ATP的贡献一般不超过50%～60%［20］。因此，线粒体的OXPHOS仍然对肿瘤细胞的能量需求有相当的贡献［21-22］。那么，ω-3多不饱和脂肪酸对肿瘤细胞线粒体结构功能有何影响？CHAPKIN研究［23］表明ω-3多不饱和脂肪酸可诱导上皮细胞线粒体膜磷脂成分的变化，导致线粒体膜电位下降和细胞内活性氧生成增加，细胞呼吸链电子传递受损。COLQUHOUN［24］研究发现，ω-3多不饱和脂肪酸EPA可降低大鼠肉瘤细胞线粒体呼吸链膜蛋白复合体Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ的活性，使线粒体的能量代谢受损。本实验结果显示单用DHA、5-FU分别干预AGS细胞48h后，与对照组比较，AGS细胞线粒体呼吸链膜蛋白复合体表达显著下降。二者联合干预，线粒体膜蛋白复合体表达下降更明显，说明二者具有协同作用。这就提示DHA和5-FU可抑制AGS细胞线粒体呼吸链膜蛋白复合体的表达，即分别抑制了线粒体两条氧化呼吸链中的入口途径和出口途径，进而影响AGS细胞线粒体OXPHOS的功能，从而抑制AGS细胞能量代谢，起到抑制肿瘤的作用。

综上所述，本研究证实DHA和5-FU合用可协同抑制人胃腺癌细胞株AGS的生长增殖。二者合用可明显减少5-FU的用量。协同抑制作用的机制可能是抑制线粒体呼吸链膜蛋白复合体表达而干扰细胞能量代谢和阻滞细胞周期于G0／G1期。

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