肿瘤miRNAs调控机制的研究进展与展望

黄 辰，刘利英，倪 磊，宋土生

（西安交通大学医学部：1．基础医学院细胞生物学与遗传学系；2．生物医学研究实验中心，环境与疾病相关基因教育部重点实验室，陕西西安 710061）

目前，研究显示人类基因组包含20 805个蛋白质编码基因和37 147个非编码基因和假基因，它们通过RNA加工与编辑形成196 501个基因转录本（GRCh37．p13primary assembly）［1］。根据编码功能，RNA可以分为两大类：编码RNA和非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）。编码 RNA主要指作为蛋白质翻译模板的RNA，即mRNA。而ncRNA又可以根据其长短分为长非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和短非编码 RNA（sncRNA）［2］。而根据生物学功能，RNA又可以分为两大类：翻译相关RNA和调节性RNA。前者主要包括mRNA、tRNA和rRNA，后者主要包括lncRNA、siRNA（small interfering RNA）、miRNA （microRNA）、piRNA（PIWI-interacting RNAs）、saRNA （small activating RNA）、PASRs（promoter-associated small RNAs）、tiRNA（transcription initiation RNA）以及其他小 RNA等。其中，miRNA以其种类多、作用广泛，而受到学术界的关注。

miRNA是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20～25个核苷酸［3］。成熟的miRNAs参与了生命活动的发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等调节途径。以下主要探讨肿瘤中miRNA的调控及其作用机制，以及其在未来的研究发展趋势。

1 miRNA的生物发生及其作用机制

绝大多数的miRNAs是从基因组中的间隔区转录而来，其中人类有25%左右的miRNA位于基因的内含子，并与前体mRNA同向转录。首先，由RNA聚合酶Ⅱ转录出miRNA中间转录本pri-miRNA，并经历5′端的戴帽和3′端poly A的加尾等加工过程。pri-miRNA进一步折叠形成具有1个或多个发卡式的二级结构，包含一个33bp左右的颈状区和10核苷酸的环状末端。其发卡式结构是miRNA的基本单元，被核内的RNA聚合酶ⅢDrosha和共因子DGCR8（哺乳动物）或Pasha（昆虫或蠕虫）识别，并在颈环状结构的颈端11bp的位置进行切割，产生2nt 3′端掉尾的颈环状结构，即pre-miRNA。pre-miRNA被exportin-5和共因子Ran-GTP从细胞核转运到细胞质。RNA聚合酶ⅢDicer-1及其伴侣分子TRBP或PACT（哺乳动物）将pre-miRNA加工形成～22-nt双链RNAs，其两端分别有2nt核苷酸的尾部，称为 miRNA／miRNA＊双链［4-6］（图1）。

图1 miRNA生物发生与作用机制Fig．1 The biogenesis and mechanism of miRNA

miRNA发挥生物学效应需要AGO蛋白的参与。在哺乳类动物中，AGO蛋白家族有4个成员，即AGO1-4［7-8］。AGO结合在低自由能的miRNA／miRNA＊双链的一侧，偏好尿嘌呤，并严格识别miRNA的5＇端单磷酸。该过程需要依赖ATP以及Hsc70／Hsp90伴侣复合体，形成RISC。miRNA的种子区是结合靶mRNA的关键，RISC将miRNA导向靶 mRNA［4］。AGO直接与P-body蛋白TNRC6（哺乳动物）相互作用，募集CCR4-NOT和PAN2-PAN3去腺苷化酶复合体，缩短靶mRNA的polyA［9］。同时，miRNA也可抑制蛋白质的翻译启动，但机制尚不清晰。

2 miRNA的转录前调节

表观遗传变化包括DNA甲基化、组蛋白修饰等，通过调节染色质重塑以及基因表达而参与人类的疾病发生。在肿瘤组织中，常可观察到抑癌作用的miRNA表达下调，如 miR-302b、miR-338-3p、let-7b等分别在肝癌、胃癌以及口腔癌中呈现低表达状态［10-12］。

miRNA的表达下调，与表观修饰、杂合性丢失以及相关转录因子失活有关。其中，表观修饰异常是最为关键的因素。研究表明，miR-124家族成员可以靶向CDK6，从而引起Rb基因的磷酸化下降，抑制细胞的增殖活性［13］。其在结直肠癌［14-15］、急性淋巴细胞性白血病［16］、宫颈癌［17］等肿瘤中低表达，基因发生高甲基化修饰。miR-34家族成员作为P53的靶基因，通过抑制MET、CDK4、CCNE2和 MYC等增殖相关基因，阻滞了细胞周期，诱导了细胞凋亡［18-20］。miR-34a和 miR-34b／c的基因分别位于1p36和11q23，启动子区均含有CpG岛，在口腔癌、食管癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、肾癌以及黑色素瘤等肿瘤中呈现高甲基化修饰［21-24］。miR-9的启动子高甲基化修饰最早发现于乳腺癌［25-26］和胰腺癌［27］。其后发现miR-9-1的甲基化修饰与结直肠癌淋巴结转移相关［28］；miR-9-1和miR-9-3的甲基化修饰也与肾细胞癌转移复发相关［29］。而在胃癌组织中，miR-9家族3个成员均发生甲基化，异位表达miR-9可以抑制细胞增殖以及侵袭转移［30］。已有证明，癌基因FGFR1［31］、CDK6［32］和 CDX2［33］为 miR-9直接作用靶点。其他由于DNA甲基化而引起表达异常的 miRNA 还包括 靶向 FOXP1、HDAC4、ANXA2和 MET的miR-1［34-36］，靶向SOX4的 miR-129-2［37］，靶向 CDC42、LSD1、CDK6、EZH2、MIB1的 miR-137［38-41］，靶向 MYC、MUC1、IRS-1、FSCN1的 miR-145［42-45］以及 miR-125b等。

3 miRNA的转录后调节网络

3．1 miRNA的ceRNA调节 竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）调控机制是由哈佛大学的SALMENA等总结了miRNA的研究资料后提出的。ceRNA是指细胞内具有miRNA结合位点（miRNA response elements，MRE），并参与miRNA靶转录本竞争结合的内源RNA分子［46］。

传统观念认为miRNA通过主动与靶miRNA的MRE特异性结合而诱导其降解或抑制翻译。然而，新近的研究表明，具有MRE位点的mRNA、假基因的转录本或lncRNA可以通过竞争性结合miRNA而抑制miRNA对靶mRNA的沉默效应［47-48］（图2）。

图2 ceRNA对miRNA的网络调控Fig．2 ceRNA control miRNA by network

mRNA作为ceRNA的现象非常普遍。例如，在胃癌组织中，miR-126作为抑癌基因可以靶向癌基因Crk、PI3KR2，同时也发现miR-126可以抑制抑癌基因PLK2的表达［49］。这些基因均可确认为miR-126的ceRNA。miR-145是已经确认的肝癌的抑癌基因，其在肝癌细胞中的靶向基因包括IRS1［43］、SOX9［50］、HDAC2［51］等。

除了mRNA可以作为miRNA的ceRNA以外，假基因也是重要的ceRNA来源。假基因PTENP1和抑癌基因PTEN拥有很多共同的MRE，两者可以通过竞争性结合相同的miRNA分子，如miR-17、miR-19、miR-21、miR-26和 miR-214，而实现相互调控。PTENP1的高表达将竞争抑制这些miRNA的活性，进而促进了PTEN的表达而发挥抑癌作用。假基因KRASIP和KRAS之间也具有相似的调控作用［52］。lncRNA 可以作为非编码的 ceRNA，其对miRNA的调节能力要高于mRNA来源的ceRNA。研究证明，肝癌组织中高表达的HULC，可以作为miR-372的海绵抑制物，抑制miR-372的活性，而导致其靶基因PRKACB翻译升高［53］。在干细胞中，非编码linc-RoR 高表达，并与 OCT4、SOX2以及NANOG同时与miR-145发生作用，从而抑制了miR-145效应。在细胞分化过程中，linc-RoR表达下调，对miR-145抑制作用下降，导致miR-145抑制OCT4、SOX2和 NANOG表达的作用提高［54］。

近年研究发现，ncRNA还包含着一种环状RNA（circular RNA，circRNA），也具有ceRNA 的作用。第一个被报道的circRNA是ciRS-7，其结构上具有70多个保守的miRNA靶位点，包括miR-7。在鼠脑组织中，ciRS-7高度表达，抑制了 miR-7的活性［55-56］。circRNA的作用并非是ciRS-7特例。miR-7作为抑癌基因，靶向下调 EGFR［57］、CCNE1［58］、睾丸决定因子（sex-determining region Y，SRY）。SRY是睾丸特异性circRNA，其可以作为miR-138的海绵，抑制其活性［55］。circRNA在细胞中的调控作用可能有3种方式：miRNA的抑制剂、miRNA缓冲调节以及miRNA的储存器（图3）。

图3 circRNA的作用模式Fig．3 Action mechanism of circRNA

3．2 miRNA的RNA结合蛋白调控 RNA结合蛋白（RNA binding protein，RBP）是一类参与转录后调控的蛋白质，其在mRNA上的结合位点可以横跨5＇端或3＇端，根据其蛋白质种类、mRNA或细胞背景的不同，对翻译过程具有促进或抑制作用［59］。

近年研究发现，RBP可以与miRNA共同参与转录后调控。RBP参与的miRNA调控机制存在2种模式，即合作型与竞争抑制型。Pumilio蛋白是一类合作型RBP，其主要结合于mRNA的miRNA结合域的邻近位点，改变mRNA的空间构象，有利于miRNA与靶mRNA的结合，促进miRNA抑制蛋白质翻译效应。在乳腺癌细胞系MCF7中，Pumilio结合于p27Kip1mRNA上，诱导其发生构象改变，暴露出miR-221／222结合位点，进而导致p27Kip1表达下调，引起细胞增殖［60］。而在膀胱癌中，Pumilio结合某些miRNAs而抑制癌基因E2F3的表达，但是这些miRNA在膀胱癌中常表现为选择性下调［60-61］。Dnd1蛋白是一类竞争型RBP，在生殖细胞肿瘤的形成中发挥抑制作用。Dnd1主要作用于p27Kip1和LATS2等mRNA的3＇UTRs区，阻止了miRNA对这些靶基因的抑制作用，从而维持了p27Kip1和LATS2等的抑癌活性［62］。在DNA损伤修复时，P53将诱导RBM38表达，并通过与mRNA 3＇UTRs区结合，阻止miRNA对靶基因的翻译抑制［63］。RBP对miRNA的调节还涉及miRNA形成相关的蛋白质，如DICER、AGO等，本文不再赘述。

4 miRNA的研究误区与发展方向

不同的miRNA在不同细胞中的作用方式不同，与细胞背景有着密切关系。目前，对miRNA的功能研究多是通过生物信息预测，分析其作用靶基因，并结合报告基因的研究方法分析其靶向关系，并通过细胞学实验，证明其作用机制。然而，细胞中miRNA的靶基因极其复杂，不同靶基因互相形成ceRNA，从而影响miRNA对单一目标靶基因的调控作用。本研究组在前期的报告基因研究结果证明，miR-195可以直接靶向CCNE1 3′UTRs区。但是，细胞学实验表明，miR-195不但不能抑制细胞内源CCNE1，而且可以促进其表达。该研究提示，miR-195可能对其他mRNA的亲和力高于CCNE1mRNA，并且miR-195可能影响了CCNE1的抑制因素，从而诱导CCNE1高表达（图4）。因此，现行的miRNA研究方案存在一定的缺陷。

图4 miR-195靶向CCNE1Fig．4 miR-195targeted CCNE1

目前miRNA研究亟需解决以下问题：①特定细胞中miRNA的靶mRNA的数量；②不同mRNA与miRNA的作用强弱；③ceRNA在特定细胞中对miRNA的调节；④miRNA调控的网络关系以及反馈机制。miRNA高通量靶基因的鉴定系统的建立，将是miRNA网络调控研究的关键。然而，目前为止，尚无高效简洁的研究特异miRNA在特定细胞中网络调控机制的技术。建立该项技术，将为miRNA的研究奠定坚实的基础。

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