TNF-α基因-308位点多态性与新疆维吾尔族、哈萨克族人群中支气管哮喘的关系

朱 佳，李忠凯，凌 敏

（新疆维吾尔自治区人民医院呼吸二科，新疆乌鲁木齐 830000）

支气管哮喘（bronchial asthma，BA）是一种由多种炎性细胞因子参与的慢性非特异性炎症疾病。目前，公认的观点是该病的发生、发展可能与遗传因素，环境因素及其相互作用有关，且具有家族聚集倾向和种族地域差异性［1-2］。

TNF-α基因是多功能细胞因子，其多态性与TNF-α的功能相关，且可能会影响其转录水平［3］，进而影响疾病的发展和预后。TNF-α基因序列分析显示，其上游调控区的-308位点存在碱基G-A的转换［4］。关于TNF-α基因多态性与BA相关性的研究结论并不相同。崔丽英［5］和杨剑等［6］在新疆维吾尔族和汉族人群中研究发现TNF-α基因多态性与支气管哮喘无相关性。而李莹［7］和高金明等［8］在青岛地区汉族人群及中国北方人群研究发现二者存在相关性，这与WINCHESTER［9］及崔天盆等［10］在爱尔兰人群中儿童及澳大利亚儿童中的研究一致。提示TNF-α基因多态性与BA易感性在不同人群中的作用机制有可能不同，有必要进一步研究不同人群与BA的易感性。

新疆地区各民族居住相对集中和固定，在许多地域还保留着世代完整的遗传隔离群，遗传学资源十分丰富，是研究少数民族基因多态性的理想区域。目前，关于TNF-α基因-308位点的多态性与新疆哈萨克族、维吾尔族人群支气管哮喘易感性的研究尚未见报道。本研究以新疆哈萨克族、维吾尔族人群为研究对象，分析支气管哮喘组与对照组TNF-α基因-308位点的基因型分布特征，以探讨TNF-α基因多态性与新疆维吾尔族、哈萨克族人群BA易感性的关系。

1 对象与方法

1．1 研究对象 在新疆维吾尔自治区人民医院呼吸科门诊或住院治疗的新疆维吾尔族及哈萨克族BA患者中各收集60例，均符合《支气管哮喘的诊断标准诊治指南》标准［11］，其中维吾尔族BA组：男性32例，女性28例，平均年龄（54．3±15．1）岁；哈萨克族BA组：男性29例，女性31例，平均年龄（54．5±12．2）岁；同时选取本院健康体检者维吾尔族60例和哈萨克族60例为对照组，4组之间年龄、性别比较均无统计学差异（P＞0．05），具有可比性；排除标准：有严重的心、脑、肝、肾等疾病；高血压、糖尿病、免疫系统疾病等与HLA相关疾病及有家族史者；近1个月内使用糖皮质激素及免疫抑制剂者；哮喘持续状态危重患者或资料收集不全者。

4组对象均为无民族间遗传干扰、无血缘关系的连续两代及以上长期居住于新疆的维吾尔族、哈萨克族人群，所有受试者均签署书面的志愿书，该研究由本单位的伦理委员会批准。

1．2 研究方法 ①标本采集：在清晨空腹时采集研究对象的静脉血2mL，EDTA抗凝，上下颠倒混匀，-20℃低温保存。②基因组DNA提取：利用全血基因组DNA快速提取试剂盒（离心柱型），按照厂家提供的说明书提取全血基因组DNA。提取的DNA置于-20℃保存备用。③引物合成：参照SAKAO等［3］设 计 的 引 物，上 游 引 物：5′-AGGCAATAG-GTTTTGAGGGCCAT-3′，下游引物：5′-GAGCGTCTGCTGGCTGGGTG-3′。④PCR扩增：PCR反应体系（35μL）：10mmol／L dNTP混合物2μL，10×Tap Buffer 3．5μL，2UTapDNA聚合酶，10μmol／L上下游引物各1μL，超纯水补足至35μL。所用试剂及引物均购置于北京鼎国生物工程公司。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，63℃退火40s以及72℃延伸60s共35个循环；然后72℃延伸10min，最后4℃保存。10g／L的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物扩增出目的条带的质量。⑤测序：PCR产物经纯化后由北京鼎国生物工程公司进行反向测序。测定结果出现双峰，即为该位点的杂合子（AG型）型，出现单峰则为纯合子型（AA型或GG型）。

1．3 数据处理 采用SPSS 17．0统计软件进行分析，各组间基因型和等位基因频率的比较以及Hardy-Weinberg遗传平衡定律的吻合度检验采用χ2检验；计量资料以均数±标准差表示，均数比较采用两独立样本的t检验；多因素调整采用Logistic回归分析，计算比值比（odds ratios，OR）和95%可信区间（confidence intervals，CI）用来检测 TNF-α基因-308位点多态性和BA的相关性。所有统计均为双侧，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 Hardy-Weinberg平衡检验结果 根据测序结果，统计实验个体中的AA型、AG型和GG型，经卡方检验后发现研究对象处于Hardy-Weinberg平衡（P＞0．05），说明本研究采用的研究对象具有群体代表性，可以反映整体维吾尔族、哈萨克族人群基因的分布情况。

2．2 测序结果及基因型的判定 测序结果显示，TNF-α基因-308位点存在GG、GA和AA 3种基因型，如图1所示。

2．3 TNF-α基因-308位点的基因型和等位基因的分布 根据测序结果，统计TNF-α基因-308位点的基因型和等位基因频率（表1）。

2．4 TNF-α基因-308位点的基因型及等位基因与BA易感性的关系 以研究对象是否患BA为因变量经Logistic回归分析（协变量包括年龄、性别、GG、GA、AA基因型），经调整年龄、性别后，维吾尔族及哈萨克族BA组A等位基因频率均高于对照组，可能与BA的发病风险有关（OR＝0．182，95%CI＝0．083～0．398；OR＝0．399，95%CI＝0．195～0．816），差异有统计学意义（P＜0．05）。提示A等位基因可能是BA的危险因素，可从基因水平上解释个体间BA易感性存在差异（表2）。

图1 新疆维吾尔族、哈萨克族人群中TNF-α基因-308位点的测序结果Fig．1 TNF alpha gene-308polymorphism of the sequencing results among Xinjiang Uighur and Kazakh

表1 TNF-α基因-308多态位点的基因型和等位基因的分布Tab．1 TNF alpha gene-308polymorphic loci of the distribution of genotype and allele ［n（%）］

表2 TNF-α基因-308位点的基因型和等位基因与BA易感性的关系Tab．2 Relationship of genotypes and alleles of TNF alpha gene-308loci with BA susceptibility

2．5 不同人群BA组和对照组TNF-α-308位点A等位基因频率的分布比较 如表3所示，TNF-α-308位点 A 等位基因频率在土耳其人群［17］、蒙古族［5］、汉族［5］、新疆维吾尔族［6］人群BA组和对照组比较均无显著性差异（P＞0．05），TNF-α-308位点 A等位基因频率在韩国人群［2］、本研究维吾尔族及哈萨克族中A等位基因频率在两组间有统计学差异（P＜0．05），与BA的发生存在相关性。

表3 不同人群TNF-α基因-308位点的A等位基因与BA易感性的关系Tab．3 Relationship of A alleles of different groups of TNF alpha gene-308loci with BA susceptibility （%）

3 讨 论

BA是由多种细胞特别是肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞等参与的慢性气道炎症。近几年，BA的发病率逐年升高，尤其是北方地区，风沙、花粉、冷空气等对易感人群的刺激，使BA的发病率有持续增高的趋势。因此，国内外对其发病机制及其防治的研究成为目前研究的热点［12］。目前，关于TNF-α基因-308多态性与BA相关性的研究中，不同种族的分析结果并不一致，有必要继续对其他种族TNF-α基因-308多态性与BA的关系进行研究，以确定其在BA发生和发展中的作用。

新疆维吾尔族、哈萨克族人群至今仍保留有相对完整的隔离遗传体系，是进行复杂疾病分子流行病学研究的理想人群。本研究结果显示在维吾尔族、哈萨克族人群BA组和对照组中，TNF-α基因-308位点均以GG基因型多见；BA组GA基因型和A等位基因的频率均高于对照组，且两组间差异有统计学意义（P＜0．05）。A等位基因可能是BA的危险因素，携带GA和AA基因型患者发病风险较高，提示TNF-α基因-308多态性与新疆维吾尔族、哈萨克族BA的易感性有关。

本研究与崔天盆等［10］在澳大利亚儿童中的研究与姜晓萍［13］及翟芝芳等［14］在黑龙江人群和山东地区汉族人群中研究一致：TNF-α基因-308多态性与BA的发病相关。而与 LOUIS［15］、SHIN［16］及 AYTEKIN等［17］分别对白种人、韩国人群、土耳其人群的研究结果相反，未发现与之有关。这说明TNF-α-308位点在不同人群中的作用机制或对BA的影响不同，可能与人种、民族或地域等差异有关。

本研究结果提示，可通过检测TNF-α-基因启动子区-308位点的基因型来评估维吾尔族、哈萨克族人群患BA的风险程度。因此，TNF-α-308A等位基因在临床上可作为遗传性标记进行检测，在一定程度上发现和预防BA的高危人群。在今后的研究中，应继续扩大样本量，研究不同人群的易感基因，为最终揭示BA发生发展的分子机制，控制BA的发生提供更多的科学依据；也为研究维吾尔族、哈萨克族人群中与TNF-α基因多态性相关的其他疾病提供了基础。

［1］贾南，管立学，李海波，等．TNF-α基因-308G／A多态性与儿童哮喘的相关性研究［J］．潍坊医学院学报，2012，34（6）：455-457．

［2］KIM HB，KANG MJ，LEE SY，et al．Combined effect of tumour necrosis factor-a and interleukin-13 polymorphisms on bronchial hyperresponsiveness in Korean children with asthma［J］．Clin Exp Allergy，2008，38（5）：774-780．

［3］SEVENOAKS MJ，STOCKLEY RA．Chronic obstructive pulmonary disease inflammation and co-morbidity：a common inflammatory phenotype？［J］．Respir Res，2006，7：70．

［4］SAKAO S，TATUSUMI K，IGARI H，et al．Association of tumor necrosis factor-alpha gene promoter polymorphism with the presence of chronic obstructive pulmonary disease［J］．Am J Respir Crit Care Med，2001，163（2）：420-422．

［5］崔丽英，王宏英．内蒙古地区蒙汉族人群TNF-α基因多态性与支气管哮喘的相关性［J］．内蒙古医学学报，2010，32（4）：354-357．

［6］杨剑，李风森，苏军，等．新疆汉族、维吾尔族支气管哮喘患者TNF-α基因-308位点的多态性与中医证型相关性研究［J］．世界科学技术-中医药现代化，2013，3（15）：586-590．

［7］李莹，纪霞，王海燕，等．青岛地区支气管哮喘患者TNF-α基因rs1800629位点多态性与表达及TNF-α、内皮素相关性研究［J］．中华哮喘杂志，2013，4（7）：89-94．

［8］高金明，林耀光，邱长春，等．肿瘤坏死因子α及淋巴毒素α基因多态性和支气管哮喘患者的关系［J］．中华结核与呼吸杂志，2002，7（25）：444-445．

［9］WINCHESTER EC，MILLWOOD IY，RAND L，et al．Association of the TNF-alpha-308 （G-A）polymorphism with selfreported history of childhood asthma［J］．Hum Genet，2000，107：591-596．

［10］崔天盆，吴健民．支气管哮喘基因研究进展［J］．国外医学临床生物学化学与检验学分册，2003，24（5）：270-271．

［11］中华医学会呼吸病学分会哮喘学组．中国支气管哮喘防治指南（基层版）［J］．中华结核与呼吸杂志，2013，5（26）：331-336．

［12］孙钰锋，常晓悦，孙伟晶．TLR4和TNF-α基因多态性与支气管哮喘的相关性研究［J］．临床肺科杂志，2013，4（18）：662-664．

［13］姜晓萍，曹锋林，王文宝，等．肿瘤坏死因子的基因型与支气管哮喘的相关性［J］．黑龙江医学，2002，26（5）：330-331．

［14］翟芝芳，李玉．肿瘤坏死因子-α基因多态性与支气管哮喘相关性研究［J］．山东医药，2004，44（25）：4-6．

［15］LOUIS R，LEYDER E，MALAIS M，et al．Lack of association between adult asthma and the tumor necrosis factor alpha-308 polymorphism gene［J］．Eur Respir，2000，16（4）：604-608．

［16］SHIN HD，PARK BL，KIM LH，et al．Association of tumor necrosis factor polymorphism with asthma and serum total IgE［J］．Hum Mol Genet，2004，13（4）：397-403．

［17］AYTEKIN C，DOGO F，IKINCIOGULLARI A，et al．TGFBeta l-915G／T and TNF-alpha-308G／A polymorphisms in children with asthma［J］．Tu-berk Toraks，2009，57（1）：62-67．