褐藻多糖硫酸酯与山楂提取物混合剂的降血脂作用

王亚芳，汪秋宽，何云海，任丹丹，林茹，宋悦凡，丛海花

(大连海洋大学食品科学与工程学院，国家海藻加工技术研发分中心，辽宁省水产品加工及综合利用重点实验室，辽宁大连116023)

心脑血管疾病严重危害人类健康，而脂质代谢与心脑血管疾病密切相关，脂质代谢紊乱所致的动脉粥样硬化是引起心脑血管疾病发生、发展的重要危险因素［1］。不仅如此，血脂浓度升高还会增加心脑血管疾病患者的死亡率，因此，如何通过饮食调节脂质代谢、预防心脑血管疾病的发生，已成为科研工作者研究的热点［2-4］。

厚叶海带是一种4～5年生亚寒带可食用藻类，也是一种具有较高经济价值的巨型海藻，厚叶海带含有优质的褐藻多糖硫酸酯，含量比其他藻类要多［5］。裙带菜隶属于褐藻门、褐藻纲、海带目、翅藻科、裙带菜属，其中裙带菜孢子叶含有丰富的蛋白质与多糖［6］。褐藻多糖硫酸酯是一种水溶性杂聚糖，是褐藻和一些海洋无脊椎动物的组成成分［7］，主要是以L-岩藻糖和硫酸根组成，还伴有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、糖醛酸、蛋白质和钾、钠、钙等金属离子［8］。已有研究表明，褐藻多糖硫酸酯具有抗氧化、降血脂等多种生物活性［9-13］。而山楂营养丰富，具有丰富的小分子酸和糖等物质，自身具有降血脂作用［14］。本研究中，用不同剂量的山楂提取物与褐藻多糖硫酸酯配伍的混合剂，灌胃高脂大鼠，并对其血清及肝脏组织各项指标进行测定，分析了其混合剂的降血脂作用。

1 材料与方法

1.1 材料

日本厚叶海带、裙带菜孢子叶褐藻多糖硫酸酯及山楂提取物由大连海洋大学国家海藻加工技术研发分中心提供。

试验动物为清洁级Wistar大鼠，共56只，体质量为150～170 g，由大连医科大学SPF实验动物中心提供。

试验试剂:L-岩藻糖、D-半乳糖、苯酚、浓硫酸、浓盐酸、氨水、硫酸钾、山梨醇、氯化钡均为市售分析纯;猪胆盐、胆固醇、猪油、脂必妥均为市售食用级的;总胆固醇 (TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白 (LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、丙二醛 (MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-PX)、一氧化氮 (NO)测定试剂盒与蛋白定量测定试剂盒均购自南京建成生物工程公司。

主要仪器及设备:721型可见分光光度计 (上海光谱仪器有限公司)、HWS24电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)、高速多功能粉碎机 (永康市绿可食品机械有限公司)、iMark酶标仪 (Bio-RAD)、LD5-2A低速离心机 (北京医用离心机厂)。

1.2 方法

1．2．1 褐藻多糖硫酸酯组分含量的测定

(1)总糖含量。采用苯酚硫酸法［15］，准确称取21 mg(L-岩藻糖∶D-半乳糖=3∶1)，用去离子水溶解并定容至500 mL。分别取标准溶液0、0．4、0．6、0．8、1．0、1．2、1．4、1．6、1．8 mL 加入到9个25 mL的比色管中，向9个比色管中分别加入 2．0、1．6、1．4、1．2、1．0、0．8、0．6、0．4、0．2 mL去离子水，然后加入6%苯酚溶液各1 mL，最后加入浓H2SO4各5 mL。摇匀后静置，冷却至室温后在490 nm处测其吸光度值，以标准糖含量(mg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

分别称取0．01 g日本厚叶海带、裙带菜孢子叶褐藻多糖硫酸酯样品，溶解并定容至100 mL，吸取配好的样液1．0 mL，按照上述步骤，测定其吸光度，从标准曲线上计算得出样品的总糖含量。

(2)硫酸根含量。采用明胶BaCl2法［16］，称取两种褐藻多糖硫酸酯样品0．1 g，分别放入25 mL的比色管中，加入2 mol/L盐酸10 mL，然后将其置于室温下过夜，封管后放入105～110℃的烘箱中恒温水解5 h，取出，冷却至室温。用2 g颗粒活性炭脱色，再用滤纸过滤，水洗，将滤液和洗涤液合并，用5 mol/L NH4OH中和至pH值为6～7，移入50 mL容量瓶中并定容至刻度，待用。

分别吸取 0、0．1、0．3、0．5、0．7、0．9 mL 0．05%K2SO4溶液以及0．5 mL样品稀释液于比色管中，各以水补至4 mL，依次加入体积分数为50%的盐酸0．8 mL、70%的山梨醇溶液4 mL和200 g/L氯化钡溶液4 mL，混合均匀后放置10 min，于470 nm处比浊得标准曲线，计算样品的硫酸根含量。

1．2．2 混合剂的降血脂作用

(1)高脂饲料的制作。基础饲料由大连医科大学SPF实验动物中心提供。将胆固醇与猪胆盐按比例充分混匀，加入到基础饲料中，然后放入适量的蒸馏水用斩拌机不断搅拌，再加入融化后的猪油并充分混匀，制成含10%猪油、2%胆固醇、0．5%猪胆盐的高脂饲料，风干处理后备用。

(2)试验设计。将Wistar大鼠 (150～170 g)适应性饲养一周后，随机分为7组，每组为8只，每日灌胃，饲养方式如表1，试验周期为28 d，试验期间自由取水取食。

厚叶混合剂为日本厚叶海带褐藻多糖硫酸酯与山楂提取物 (比例1∶1)。裙带菜混合剂为裙带菜孢子叶褐藻多糖硫酸酯与山楂提取物 (比例1∶1)。

表1 大鼠的分组Tab.1 Groups of mice

(3)指标的测定。末次给药后，大鼠禁食不禁水24 h后，称重，用乙醚麻醉，将已麻醉的大鼠固定，从腹主动脉取血，以3000 r/min离心15 min，得上清液，用试剂盒测定血清 TC、TG、LDL-C、HDL-C含量;同时取肝脏、脾脏组织，计算其脏器指数;取肝脏的相同部位约0．3 g，放入冰冷的生理盐水中匀浆，制成10%肝组织匀浆液，用试剂盒测定GSH-Px、SOD活性、MDA和NO含量。通过下式计算:

动脉粥样硬化指数 (AI)=TC/HDL-C，

肝脏指数 (mg/g)=小鼠肝脏质量/体质量，

脾脏指数 (mg/g)=小鼠脾脏质量/体质量。

1.3 数据处理

用Excell将试验数据进行处理并以平均值±标准差表示，采用SPSS 17．0软件进行方差分析，用Duncan法进行多重检验，显著性水平设为0．05。

2 结果与分析

2.1 褐藻多糖硫酸酯的各组分含量

从表2可见，日本厚叶海带与裙带菜孢子叶中的糖含量相近，而日本厚叶海带中的硫酸根含量较裙带菜孢子叶高。

2.2 混合剂对大鼠体质量的影响

从表3可见:与空白对照组相比，高脂模型对照组大鼠的体质量均有升高，仅第一周时有显著性升高 (P＜0．05)，其余时间点均未出现显著性差异 (P＞0．05);与高脂模型对照组相比，第28天时，仅厚叶混合剂高剂量组大鼠体质量显著降低(P＜0．05)，裙带菜混合剂高剂量组大鼠体质量极显著降低 (P＜0．01)。

表2 褐藻多糖硫酸酯各组分含量Tab.2 Contents of the components in seaweed fucoidan

2.3 混合剂对大鼠血清 TC、TG、LDL－C、HDL－C含量的影响

从表4可见:与空白对照组相比，高脂模型对照组TC、LDL-C含量极显著升高 (P＜0．01)，TG含量显著升高 (P＜0．05)，HDL-C含量有所降低，但无显著性差异 (P＞0．05);灌胃混合剂之后，与高脂模型对照组相比，厚叶混合剂和裙带菜混合剂各剂量组大鼠的TC、LDL-C含量均极显著降低 (P＜0．01)，TG含量显著降低 (P＜0．05)，而HDL-C含量有所升高，但无显著性差异 (P ＞0．05)。

表3 混合剂对大鼠体质量的影响 (n=10)Tab.3 Effects of the mixture on body weight of mice(n=10)

表4 混合剂对大鼠血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白含量的影响 (n=10)Tab.4 Effects of mixture on serum of levels TC，TG，LDL－C and HDL－C in mice(n=10) mmol/L

2.4 混合剂对大鼠血清中AI值以及脏器指数的影响

从表5可见:与空白对照组相比，高脂模型对照组AI值极显著升高 (P＜0．01)，脏器指数无显著性变化 (P＞0．05);与高脂模型对照组相比，厚叶混合剂与裙带菜混合剂各剂量组大鼠AI值均极显著降低 (P＜0．01);仅裙带菜混合剂低剂量组肝脏指数显著降低 (P＜0．05)，其余各组脏器指数均无显著性变化 (P＞0．05)。

2.5 混合剂对大鼠肝组织中MDA、NO含量和SOD、GSH－Px活性的影响

从表6可见:与空白对照组相比，高脂模型对照组的MDA含量极显著升高 (P＜0．01)，SOD活性、NO含量极显著降低 (P＜0．01);与高脂模型对照组相比，各混合剂组MDA含量均有所降低，SOD活性有所升高，但均未表现出显著性变化(P＞0．05)，GSH-PX活性极显著升高 (P＜0．01)，仅厚叶混合剂低剂量组NO含量显著升高(P ＜0．05)。

表5 混合剂对大鼠血清AI值及脏器指数的影响 (n=10)Tab.5 Effects of the mixture on serum AI，and liver and spleen indices of mice(n=10)

3 讨论

高脂血症包括高胆固醇血症、高甘油三脂血症和复合性高脂血症。已有研究表明，血清中TC、TG浓度的异常增加与心血管疾病的发生风险呈正相关，血清中的TC主要存在于LDL-C中，当LDL-C含量升高时，动脉内膜产生氧自由基聚集及其他代谢产物，使进入内皮的LDL氧化修饰，成为氧化型的低密度脂蛋白 (ox-LDL)，ox-LDL作为启动分子，在动脉粥样硬化 (AS)发生的早期起了关键作用［2］。而HDL-C可作为逆向转运TC的载体，其浓度增加可加快血液中TC的分解［17］。本试验结果表明:厚叶混合剂和裙带菜混合剂均能有效改善高脂模型组大鼠的血脂水平，减少血清TC蓄积，显著降低TG含量，极显著降低LDL-C含量和AI值。以上数据分析显示，厚叶混合剂与裙带菜混合剂均具有不同程度的分解TC的能力，减少TC在肝脏中的积累，进而达到降血脂的目的。谌素华等［13］研究表明，马尾藻岩藻聚糖硫酸酯可降低高血脂小鼠血清的TC、TG、LDL-C含量，提高HDL-C含量，同时对其动脉粥样硬化指数 (AI)有极显著的影响。Zhu等［14］研究表明，山楂中的提取物可降低血清TC、TG、LDL-C含量，降低肝脏TC含量，同时下调HMGCR、ACAT的酶活和基因表达，上调CYP7A1的酶活与基因表达。本试验结果与上述研究结果相似，提示混合剂能显著调节机体脂质代谢，有效预防高胆固醇血症和动脉粥样硬化的形成，但对其降血脂机理还有待进一步研究。

表6 混合剂对大鼠肝脏组织MDA、NO含量和SOD、GSH－Px活性的影响 (n=10)Tab.6 Effects of the mixture on heptic MDA，NO content，SOD and GSH －Px activety in mice(n=10)

此外，MDA是脂质过氧化的终产物，是反映机体脂质过氧化水平的重要指标。SOD是清除氧自由基的主要酶系，GSH-PX是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解酶，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用，SOD和GSH-Px活力的高低反映了机体抗氧化能力的强弱［18］。高胆固醇血症状态下，SOD和GSH-Px活力降低，清除自由基能力减弱，则脂质过氧化程度进一步加强。所以高胆固醇血症状态下，脂质水平升高，抗氧化能力下降，表现为严重的脂质过氧化及动脉粥样硬化 (AS)发生的高危险性［19］。本试验结果显示:裙带菜混合剂高剂量能降低大鼠体内的MDA含量，升高SOD水平，但效果不明显;而厚叶混合剂与裙带菜混合剂各剂量均能显著提高大鼠血清GSH-PX活力，具有一定的抗氧化活性。王静凤等［20］研究了两种海参对高脂大鼠的治疗效果，结果表明，菲律宾刺参和日本刺参均能明显降低高脂血症大鼠血清TC、LDL-C含量和LDL-C/HDLC值，提高HDL-C及NO含量，同时显著降低血清和肝脏中MDA含量，并提高其SOD和GSH-Px活性。本试验结果与上述研究结果相似，厚叶混合剂与裙带菜混合剂能够通过提高机体内源性抗氧化酶的活性，减少脂质过氧化反应，起到抗动脉粥样硬化的作用。

综上所述，本试验条件下，混合剂的剂量对脂质代谢的调节无明显差异，说明用混合剂灌胃大鼠均具有较好的降血脂功效，在对降血脂功效进行深入研究时，可采用更低剂量的混合剂。

［1］蔡海江．动脉粥样硬化基础及临床研究［M］．南京:江苏科学技术出版社，1996:238-248．

［2］Zhao L Y，Huang W．Hypolipidaemic effect and mechanisms of the main component of Opuntiadillenii Haw polysaccharides in highfat emulsion-induced hyperlipidaemic rats［J］．Food Chemistry，2012:964-971．

［3］叶平．血脂的基础与临床［M］．北京:人民军医出版社，2002:46-47．

［4］周根来，王恬．动物脂肪代谢营养调控［J］．饲料工业，2003，24(1):42-44．

［5］刘舒，汪秋宽，何云海，等．厚叶海带生物活性成分的研究现状［J］．水产科学，2013，13(6):361-367．

［6］朱良，王一飞，朱艳梅．裙带菜孢子叶多糖含量的测定［J］．食品科学，2005，26(10):184-186．

［7］程仕伟，陈超男，冯志彬，等．海带岩藻多糖的水提制备及其抗氧化活性研究［J］．食品科学，2010，31(6):101-104．

［8］姚兰，蒋文强，杨海涛．酸法提取海带中岩藻聚糖硫酸酯的研究［J］．食品研究与开发，2006，27(7):89-91．

［9］任丹丹，汪秋宽，张甜翠，等．海带岩藻聚糖硫酸酯对四氯化碳致肝损伤小鼠的保护作用［J］．华中农业大学学报，2009，28(6):764-766．

［10］Yu C H，Dai X Y．Hypolipidemic and antioxidant activities of polysaccharides from Rosae Laevigatae Fructus in rats［J］．Carbohydrate Polymers，2013，94:56-62．

［11］程忠玲，吴效楠．羊栖菜褐藻糖胶的抗凝血和促血管内皮细胞生长活性研究［J］．食品研究与开发，2011，32(4):165-167．

［12］李鸶鸶，汪秋宽，何云海，等．多肋藻岩藻聚糖硫酸酯的提取及其降血脂作用研究［J］．大连海洋大学学报，2013，28(1):94-98．

［13］谌素华，王维民，刘辉，等．马尾藻岩藻聚糖硫酸酯纯化及降血脂功能研究［J］．食品与发酵工业，2010，36(5):28-31．

［14］Zhu R G，LI T P．Pectin pentasaccharide from hawthorn ameliorates disorders of cholesterol metabolism in high-fat diet fed mice［J］．Food Research International，2013，54:262-268．

［15］张惟杰．复合多糖生化研究技术［M］．上海:上海科学技术出版社，1987:6-7．

［16］张惠芬，李宝才，范家恒，等．盐酸水解-硫酸钡重量法测定硫酸酯化多糖硫酸基含量方法考察［J］．食品科学，2002，28(5):107-111．

［17］付慧，汪秋宽，何云海，等．多肋藻渣膳食纤维对小鼠降血脂作用的研究［J］．大连海洋大学学报，2012，27(3):200-204．

［18］王尊文，华玉琴，李国平，等．羊栖菜多糖对高血脂模型大鼠血脂和抗氧化功能的影响［J］．中国海洋药物杂志，2008，27(6):13-15．

［19］张京芳，张强，陆刚，等．香椿叶提取物对高血脂症小鼠脂质代谢的调节作用及抗氧化功能的影响［J］．中国食品学报，2007，7(4):3-7．

［20］王静凤，逄龙，王玉明，等．两种海参对实验性高脂血症大鼠治疗作用的比较研究［J］．中国海洋大学学报:自然科学版，2007，37(4):597-600．