甘油生产1,3-丙二醇发酵工艺优化研究

姚新武，张 霖，樊亚超

（中国石化抚顺石油化工研究院，辽宁 抚顺 113001）

甘油生产1,3-丙二醇发酵工艺优化研究

姚新武，张 霖，樊亚超

（中国石化抚顺石油化工研究院，辽宁 抚顺 113001）

1,3-丙二醇是合成聚对苯二甲酸丙二醇酯的基础原料，利用甘油进行微生物发酵生产1,3-丙二醇的生物炼制技术具有广阔的应用前景。以克雷伯氏肺炎杆菌为出发菌种，对菌种保藏方式、发酵体系环境、氮气通气比、pH中和剂以及甘油品质等发酵工艺进行了优化研究。实验结果表明，在较优的工艺条件下，1,3-丙二醇产量可达103.38 g/L。

克雷伯氏肺炎杆菌；1,3-丙二醇；发酵工艺；优化

1,3-丙二醇（1,3-PDO）可用于化妆品、液体清洁剂、防冻液、服装、室内装饰材料、工程聚合物等诸多领域。作为一种含有双功能团的二醇，1,3-PDO最重要的应用方向是与对苯二甲酸缩聚生成聚对苯二甲酸丙二醇酯（PTT）[1]。目前国际上1,3-PDO主要生产厂商有德国Degussa公司、荷兰Shell公司和美国Du Pont公司，国内1,3-PDO产量较少，主要依靠从国外进口。

1,3-PDO的合成方法分为化学法和微生物法[2]，其中后者以甘油生物转化法和葡萄糖生物转化法最为常见。甘油是油脂工业的主要副产物，生物柴油技术的推广将产生大量的廉价副产物甘油，因此开发条件温和、原料价廉易得的利用甘油进行微生物发酵生产1,3-PDO的生物炼制技术具有广阔的应用前景。目前虽然有大量关于1,3-PDO生产的研究，但少有研究关注利用甘油生产1,3-PDO的发酵工艺优化。

本文以克雷伯氏肺炎杆菌（K. pheumoniae）为菌种，对以甘油为底物生产1,3-PDO的发酵工艺进行了优化研究。

1 实验部分

1.1 菌种

菌种为中国石化抚顺石油化工研究院自主筛选的K. pheumoniae FY-5，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），编号为0798。

1.2 菌种的培养和发酵[3]

种子培养基：酵母粉 3.0 g/L、麦芽粉 3.0 g/L、蛋白胨 5.0 g/L和NaCl 5.0 g/L。

基本发酵培养基：酵母粉 5.0 g/L、K2HPO4·3H2O 10.0 g/L、KH2PO42.0 g/L、NH4Cl 1.0 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L、FeCl3·6H2O 30 mg/L、CoCl2·6H2O 5 mg/L、维生素B125 mg/L和甘油 30.0 g/L。

在含有100 mL种子培养基的250 mL三角摇瓶中接种K. pheumoniae FY-5，37 ℃和140 r/min摇床培养10 h。

以体积分数5%的接种量接入到1 L发酵罐中进行批次发酵，培养基为基本发酵培养基，工作体积为0.7 L，发酵过程pH维持在7.0，发酵温度为37 ℃，搅拌转速为300 r/min。

在15 L发酵罐中进行分批补料发酵，培养基为基本发酵培养基，工作体积为7 L，发酵过程中将甘油浓度控制在10～40 g/L，发酵过程pH维持在7.0，发酵温度为37 ℃，搅拌转速为300 r/min。

1.3 分析方法

甘油、1,3-PDO用HPLC检测（Dionex配Bio-Rad HPX-87H色谱柱柱），检测器为示差检测器，流动相为0.005 mol/L的H2SO4溶液，流速0.8 mL/min，柱温65 ℃，具体检测方法见文献[4]。

生物量（BIOMASS）采用752型分光光度计测定菌体在600 nm处吸光度（OD600），再根据标准方程将吸光度值转化成生物量。

2 结果与讨论

2.1 菌种保藏方式对1,3-PDO合成的影响

用 NaOH作 pH中和剂，氮气通气比为 0.4 m3/(m3·min)（又可称0.4 vvm），分别从冻干保藏菌种和液体保藏菌种出发，通过48 h发酵实验考察菌种保藏方式对1,3-PDO合成的影响，实验结果如表1所示。

表1 菌种保藏方式对1,3-PDO合成影响Table 1 Effect of strain preservation methods on 1,3-PDO synthesis

从表1可以看出，冻干保藏菌种的1,3-PDO产量、生产速率和生物量分别高于液体保藏菌种20.69%、19.42%和5.25%。这是由于菌种经过冻干保藏处理后可以将突变可能性降至较低水平[5]，菌种经长期保藏后再复苏活化，其体内代谢酶系和代谢通量仍能与保藏前相当，进而使冻干保藏菌种能够表现出较强的发酵性能。

2.2 发酵体系环境对1,3-PDO合成的影响

用NaOH作pH中和剂，以冻干保藏菌种为出发菌种，分别在空气通气比0.2 vvm、不通气和氮气通气比0.2 vvm条件下发酵48 h考察好氧环境、微氧环境和厌氧环境对1,3-PDO合成的影响，实验结果如表2所示。

从表2可以看出，3种发酵体系环境下1,3-PDO产量和生产速率排序为：氮气通气比0.2 vvm＞不通气＞空气通气比0.2 vvm。这是由于菌种的甘油代谢途径包括氧化和还原两个途径，厌氧环境有利于氧化途径产生的还原力 NADH2进入还原途径以供给1,3-PDO的合成[6]。此外，还原途径中的甘油脱水酶（GDHt）是菌种代谢的关键限速酶[7]，氧的存在会导致GDHt失活进而抑制菌种合成1,3-PDO[8]。

表2 发酵体系环境对1,3-PDO合成影响Table 2 Effect of fermentation system environment on 1,3-PDO synthesis

2.3 氮气通气比对1,3-PDO合成的影响

用NaOH作pH中和剂，以冻干保藏菌种为出发菌种，分别在氮气通气比0.2 vvm、0.4 vvm和0.6 vvm 条件下发酵 48 h考察不同氮气通气比对1,3-PDO合成的影响，实验结果如表3所示。

表3 氮气通气比对1,3-PDO合成影响Table 3 Effect of nitrogen ventilation ratio on 1,3-PDO synthesis

从表3可以看出，菌种的各项发酵指标随氮气通气比的增加呈现先上升后下降的趋势。当氮气通气比为0.4 vvm时，1,3-PDO产量、生产速率和生物量达到最高水平。

2.4 pH中和剂种类对1,3-PDO合成的影响

用Ca(OH)2作pH中和剂，以冻干保藏菌种为出发菌种，分别在不通气、氮气通气比0.2 vvm和氮气通气比0.4 vvm条件下发酵48 h考察Ca(OH)2对1,3-PDO合成的影响，实验结果如表4所示。

表4 Ca(OH)2对1,3-PDO合成影响Table 4 Effect of Ca(OH)2on 1,3-PDO synthesis

从表4可以看出，与NaOH作为pH中和剂相比（见表 2），在相同条件下，使用Ca(OH)2作pH中和剂时菌种的发酵水平有显著提高，最高1,3-PDO产量和生产速率分别为103.38 g/L和2.15 g/(L·h)。究其原因，一方面是由于Ca2+能改善细胞膜的通透性[9]，进而提高了底物和产物的跨膜运输效率；另一方面是由于Ca2+能有效地沉淀发酵过程中产生的 CO2，促使脱羧反应朝正向进行，期间生成的还原力提高了菌种代谢的还原途径通量，进而提高了菌种发酵水平。

分别使用NaOH和Ca(OH)2作pH中和剂时，发酵液电导率随时间变化趋势如图1所示。

图1 发酵液电导率随时间变化趋势Fig.1 Changing trend of electrical conductivity of fermentation broth with time

从图1可以看出，发酵液电导率随时间呈现出先上升后趋于稳定的趋势，使用NaOH作为pH中和剂时发酵液的电导率始终高于Ca(OH)2，终止发酵时，使用NaOH作为pH中和剂的发酵液电导率为20.12 mS，比Ca(OH)2的15.11 mS高出33.16%，说明使用NaOH作为pH中和剂时发酵液的离子强度和渗透压较高，而过高的离子强度和渗透压将导致细胞破裂死亡[10]，不利于菌种的生长和代谢。此外，从后续分离提纯角度考虑，钙离子比钠离子更易从发酵液体系中除去[11]。

2.5 甘油品质对1,3-PDO合成的影响

为考察菌种的原料适应性，本文选取了两种甘油作为原料。精甘油为北京化工厂生产，化学纯。粗甘油为生物柴油副产物，其组成为：甘油含量84.71%、甲醇含量0.74%、甘油单甲醚含量0.0061%、甘油二甲醚含量0.021%，其余为水。

分别以精甘油和粗甘油作为发酵底物，以冻干保藏菌种为出发菌种，在氮气通气比0.4 vvm条件下，分别用NaOH和Ca(OH)2作pH中和剂，发酵48 h考察甘油品质对1,3-PDO合成的影响，实验结果如表5所示。

表5 甘油品质对1,3-PDO合成影响Table 5 Effect of glycerol quality on 1,3-PDO synthesis

从表5可以看出，使用NaOH和Ca(OH)2作pH中和剂，以粗甘油作为发酵底物时菌种的1,3-PDO产量相比于精甘油分别下降了6.99%和29.44%。这是由于粗甘油中存在的生物柴油酯类、机械杂质以及其他杂质对菌种的生长和代谢具有一定抑制作用，进而导致菌种的发酵水平出现下降。这也意味着菌种的原料适应性不强，在使用粗甘油作为发酵底物前，应对其中杂质进行适当预处理。

3 结 论

（1）以冻干形式保藏的菌种具有良好活性，在发酵实验中表现出了较优的发酵性能。

（2）厌氧发酵环境有利于菌种合成1,3-PDO，当氮气通气比为0.4 vvm时1,3-PDO产量最高。

（3）使用Ca(OH)2作为pH中和剂时，发酵48 h菌种的1,3-PDO产量最高可达103.36 g/L。

（4）为满足菌种的原料适应性，生物柴油副产物粗甘油需进行预处理，将其中抑制菌种生长和代谢的杂质去除后，使其更加适用于微生物发酵生产1,3-PDO。

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Optimization of Fermentation Process for Producing 1,3-PDO From Glycerol

YAO Xin-wu, ZHANG Lin, FAN Ya-chao
(Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals, SINOPEC, Liaoning Fushun 113001, China)

1,3-PDO is the basic raw material to produce polytrimethylene terephthalate. Biorefinery technology of producing 1,3-PDO from glycerol with ferment has broad application prospect. In this paper, K. pneumoniae was chosen as the starting strain. Fermentation process parameters including strain preservation methods, fermentation system environment, nitrogen ventilation ratio, pH neutralizing agent and glycerol quality were optimized. The experimental results show that the yield of 1,3-PDO can reach to 103.38 g/L under optimum process conditions.

Klebsiella pheumoniae; 1,3-PDO; Fermentation process; Optimization

TQ 923

A

1671-0460（2015）08-1813-03

中国石油化工集团公司资助项目，项目号SH1112。

2015-06-27

姚新武（1986-），男，黑龙江大庆人，助理工程师，硕士，2012年毕业于北京化工大学微生物与生化药学专业，研究方向：生物基化学品研究与开发。E-mail：yaoxinwu.fshy@sinopec.com, 电话：024-56389324。