线粒体DNA损伤与视网膜色素上皮细胞关系的研究进展

俞永珍，邹秀兰，邹玉平

综述

线粒体DNA损伤与视网膜色素上皮细胞关系的研究进展

俞永珍，邹秀兰，邹玉平△

线粒体DNA（mtDNA）是线粒体内具有遗传效应的双股闭环DNA分子，对细胞及其功能具有重要作用。视网膜色素上皮（RPE）细胞活动亦由大量线粒体参与。因RPE细胞代谢活跃，当发生氧化应激时可引起线粒体及mtDNA损伤；当线粒体及mtDNA损伤无法及时修复而使损伤积累，可引起RPE及线粒体功能障碍，并诱发启动细胞凋亡，进而引发某些眼病，如年龄相关性黄斑变性等。现就mtDNA与RPE细胞的功能关系、mtDNA损伤修复及检测方法作一综述。

DNA，线粒体；DNA损伤；视网膜色素类；上皮细胞；活性氧；综述

视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）是视网膜代谢最活跃的区域，由单层排列整齐的六面柱状的色素细胞即RPE细胞构成，具有吞噬降解感光细胞外节段、转运营养物质及代谢产物、清除自由基等功能，这对视网膜自平衡及视觉有极为重要的意义［1］。研究发现线粒体DNA（mito⁃chondrial DNA，mtDNA）的损伤与视网膜疾病密切相关，位于视网膜最外层的RPE细胞因长期暴露于光线刺激、高氧的环境中，易受到氧化损伤，产生慢性氧化应激，这种病理变化可导致光视性视网膜损伤等眼病［2-3］。以下就mtDNA损伤和修复及与RPE细胞的关系进行综述。

1 mtDNA

1.1 结构与功能线粒体是存在于大多数真核生物体内的一种重要而独特的细胞器，外膜完整包围细胞器，内膜因向胞质内褶皱形成细胞嵴；细胞质内有酶类、内质网、核糖体及DNA。人类完整的mtDNA为一个包含有16 569个碱基对的环状双链DNA分子，能够独立地进行基因转录、翻译及蛋白的表达。mtDNA编码37个基因及13个蛋白质基因，其中编码的13个亚基是线粒体复合物参与呼吸电子传递链所必需的，故mtDNA的转录调节对于机体的能量需求非常重要。

1.2 mtDNA基因组特性mtDNA进行基因转录、翻译和表达时，具有遗传多态性，并具有以下特点：首先，双链DNA完全转录，无内含子，没有高效的修复系统；其次，mtDNA编码的基因没有相关组蛋白及其他蛋白的保护；此外，mtDNA损伤效应极易积累；最后，线粒体具有遗传异质性，即每个细胞有数百个线粒体，每个线粒体有多个DNA，因此一个细胞可同时具有正常和异常的mtDNA，从而可具有不同的遗传特性［4］。由此可见，当mtDNA在高活性氧（reactive oxygen species，ROS）等氧化应激状态下，容易使基因序列发生变化，进而使表达的蛋白发生改变，从而发生线粒体功能障碍及mtDNA损伤。根据mtDNA基因组的特性，与核DNA相比，mtDNA更易遭受氧化损伤，而且氧化应激反应对mtDNA的损伤比核DNA大10倍且更持久［5］。

2 mtDNA氧化损伤与RPE细胞

2.1 线粒体与自由基自由基是细胞内的正常产物，机体内自身存在产生-清除-抗氧化防御系统，细胞可通过酶类及抗氧化剂类，将产生的自由基清除或抵消。其中线粒体是体内氧自由基产生的主要场所，也是氧化损伤的靶细胞器。线粒体损伤与活性氧ROS的水平有关，其中mtDNA对氧化损伤更加敏感［6］。当ROS不能及时清除而积累于细胞中时，线粒体将受到氧自由基的攻击，一方面可引起线粒体数量减少、肿胀变形，线粒体能量动力学改变；另一方面引起线粒体氧化呼吸链的功能障碍，导致ROS产生增加，可进一步诱导并促进细胞凋亡［7-8］。

2.2 RPE细胞与氧化损伤RPE细胞具有支持感光细胞、维持视网膜外屏障稳定、运输营养物质等作用，故RPE所在区域代谢活跃，耗氧量高；且在RPE细胞内含有丰富的线粒体及溶酶体等亚细胞器。线粒体为RPE细胞提供代谢所需要的氧和腺嘌呤三磷酸腺苷（adenine adenosine triphosphate，ATP），因此在氧化呼吸过程中也生成了大量自由基。此外，RPE细胞属于终末有丝分裂细胞，一旦视网膜色素上皮细胞受损或死亡，则不能再生，只能依靠邻近的RPE细胞的扩张和移行来填补缺损区［9］。然而，RPE细胞内包含黑色素和脂褐素2种特殊类型的色素，通过吸收光线形成了一个辐射过滤装置，从而保护了眼内细胞免遭高能量的氧化损伤。

黑色素主要是胚胎时期及出生后第1年逐渐合成的，可产生超氧阴离子（O-2）及H2O2。Boulton［10］研究发现蓝光可诱导黑色素小体发生光动力反应而产生ROS。脂褐素是RPE细胞吞噬、消化感光细胞外节后的残留物，当感光细胞外节受到光照刺激发生氧化应激时，脂褐素可产生不同的荧光基团［11］，其中N视黄基N视黄乙醇胺（N-retinylidene-N-retiny⁃thanolenrine，A2E）是最主要的荧光基团。研究表明脂褐素在光化效应中产生大量ROS，进而对体外培养的色素上皮细胞产生光毒性［12］。随着年龄的增加，RPE细胞中的脂褐素不断累积，脂褐素的光化学反应亦增强，主要通过A2E特异性破坏细胞结构及其他小分子结构，最终可导致RPE细胞及线粒体功能障碍，进而影响视网膜正常生理功能的发挥，这与年龄相关性视网膜疾病，如年龄相关性黄斑变性的发生密切相关［13］。

2.3 线粒体与RPE细胞凋亡Li等［14］认为凋亡是RPE细胞氧化损伤的主要机制。其中RPE细胞线粒体在调控凋亡的信号传导过程中起重要作用［15］。研究证实，大量ROS未能及时清除时，机体发生的氧化应激反应可诱导线粒体膜电位降低，线粒体通透性转换孔（mitochondrialpermeability transi⁃tion pore，MPTP）开放，线粒体细胞色素C释放入胞浆［16］；同时线粒体MPTP能将Bax蛋白聚集在线粒体膜孔道周边，使形成更大的MPTP，导致细胞质的高渗性，从而激活凋亡诱导因子、pro-caspase-3等细胞凋亡因子，由此触发并激活细胞的凋亡系统，引起细胞凋亡［17］。

3 mtDNA损伤

3.1 衰老与mtDNA损伤衰老在机体表现为自身功能减退、内环境稳定能力及应激能力下降，其发展过程与线粒体功能异常关系密切，在线粒体主要以mtDNA形态变化、片段缺失、基因突变、mtDNA甲基化等生物学变化为主。早期Miquel和Cowoker提出线粒体损伤是细胞衰老和死亡的基础。此外，线粒体产生的自由基对衰老也有促进作用。由线粒体释放的信号分子，如钙离子、ROS、ATP及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucletide，NADH）可通过调控代谢的状态激活特定的细胞通路，进而引起信号的级联反应，引发线粒体调控衰老的生物活动［18-19］。

3.2 视网膜mtDNA的损伤及修复尽管线粒体的功能障碍与视网膜有关，但关于视网膜内mtDNA的损伤及修复机制的阐述并不十分清楚。视网膜mtDNA的损伤多见于衰老及氧化损伤，损伤发生后常伴有8-羟基脱氧鸟嘌呤（8-oxodG）位点损伤，此时主要通过腺嘌呤DNA糖苷酶、变位酶γ等DNA修复酶及碱基切除的方式，抑制8-oxodG表达活性或被特异性切除，从而修复损伤的mtDNA。研究已证实年龄、ROS、mtDNA损伤的积累及氧化刺激等因素可导致mtDNA氧化损伤修复功能降低或抑制［20］，这可能主要与mtDNA修复酶活性降低及mtDNA损伤修复基因如8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1（8-oxoguanine-DNA glycosylate，OGG1）有关［21］。Rózanowski等［22］也认为，随着年龄的增加，mtDNA的损伤不断增加，而mtDNA修复酶的活性逐渐降低，mtDNA修复酶8-氧鸟嘌呤-糖基化酶基因及蛋白表达水平均下降。

3.3 mtDNA氧化损伤的检测方法mtDNA氧化损伤的检测方法主要包括免疫化学方法、高表型液相色谱、气相色谱分析、电化学质谱学及聚合酶链式反应（PCR），如单链构象多态性、连接介导PCR（ligation-mediated PCR，LM-PCR）［23］。实验中mtDNA提取纯化过程会对mtDNA造成人为的损伤，因此有研究人员提出了基因和基因组特异性PCR扩增，通过这种方法可以检测到mtDNA的损伤及修复［24］。目前，该方法被应用到体内和体外的各种模型，以探测由于氧化应激导致的mtDNA损伤的特异性。其原理是：当DNA的双链发生氧化损伤时，DNA聚合酶不能在PCR反应中起作用，从而降低基因组片段的复制。因此，只有那些DNA聚合酶正常工作的DNA模板才可以正常进行扩增。

由此可知，线粒体、mtDNA的结构和功能及RPE细胞的生理特性，决定了线粒体可产生大量以ROS为代表的自由基，并发生氧化应激反应。这可能是导致线粒体、mtDNA及RPE细胞氧化损伤的主要原因之一。此外，衰老也与mtD⁃NA及RPE细胞的功能障碍密切相关。一旦损伤积累或损伤修复功能抑制或降低时，将严重影响线粒体、mtDNA及RPE细胞功能，从而诱发视网膜相关眼病的发生。

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（2014-08-10收稿2015-04-08修回）

（本文编辑李鹏）

The relationship between mitochondrial DNA damage and retinal pigment epithelium cells

YU Yongzhen，ZOU Xiulan，ZOU Yuping△
Department of Ophthalmology，Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command，Guangzhou 510010，China；△

Mitochondrial DNA（mtDNA）is a genetic effect DNA molecule of double closed loop，and is crucial for cells and their functions.Mitochondria take an active part in physiological activities of retinal pigment epithelium（RPE）cells. The oxidative stress is usually occurred in RPE for its active metabolism，which can lead to mitochondria and mtDNA dam⁃age.Once mitochondria and mtDNA lesions have not been repaired timely，the lesions can be accumulated，which can cause dysfunctions and damaged-structures of RPE and mitochondria，and can motivate the progression of cell apoptosis.In the end it can result in some ocular related diseases such as aged-related macular degeneration（AMD）.This study reviewed the functional relationship between mtDNA and RPE，and repair and detection methods of mtDNA damage.

DNA，mitochondrial；DNA damage；retinal pigments；epithelial cells；reactive oxygen species；review

R774

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.09.034

广东省科技计划项目（2011B031800202，2012B031800409）

1广州军区广州总医院眼科（邮编510010）；2广州医科大学附属第三医院眼科

俞永珍（1989），女，研究生，硕士，主用从事眼底病研究

△通讯作者E-mail：gzzouyuping@sina.com