孕妇外周血中胎儿游离DNA在产科中的应用

程丽琴(综述)，田春芳(审校)

(1.汕头大学医学院，广东 汕头 518041; 2.深圳市第七人民医院妇产科，广东 深圳 518081)



孕妇外周血中胎儿游离DNA在产科中的应用

程丽琴1△(综述)，田春芳2※(审校)

(1.汕头大学医学院，广东 汕头 518041; 2.深圳市第七人民医院妇产科，广东 深圳 518081)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.05.011

通过检测孕妇外周血中胎儿游离DNA来进行无创产前诊断、妊娠相关性疾病诊断等是目前研究的热点。在孕妇外周血中发现胎儿游离DNA主要是启发于在肿瘤患者的外周血中发现具有肿瘤特征的游离DNA，并且证实这些游离DNA大多来自患者自身的肿瘤细胞[1]。1989年，Lo等[2]首先发现在母体血浆、血清中存在高水平的胎儿游离DNA。Rijnders等[3]通过对17例行体外受精或宫腔内人工受精的孕妇进行实时聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测SRY基因，发现最早在5周2 d即可检测到SRY基因，7周时检出率达80%，9周时检出率达100%。现将孕妇外周血中胎儿游离DNA在产科方面的应用情况予以综述。

1胎儿非整倍体疾病筛查

胎儿非整倍体异常是指胎儿1个体细胞内染色体的数目增加或减少1条或数条形成的染色体数目异常；常见的胎儿非整倍体异常有唐氏综合征、13三体综合征、18三体综合征以及性染色体病[4]。非整倍异常可导致出生缺陷，给家庭和社会带来沉重负担。传统的产前诊断方法有胚胎植入前遗传诊断、绒毛穿刺取样、羊膜腔穿刺、经皮脐血穿刺技术和胎儿组织活检，这些方法都具有创伤性，有发生感染、出血、流产、死胎等风险[5](164-165)。因此，从证实母体血浆中存在胎儿游离DNA以来，胎儿游离DNA的检测及临床应用研究对非侵入性产前诊断技术产生了重大影响，现已应用于临床且易被孕妇所接受。2011年，Chiu等[6]进行了753例大样本基因测序，检测21号染色体的灵敏度达100%，特异度达97.9%。2012年，Lau等[7]对108例孕妇血浆中游离DNA进行高通量基因测序，平均妊娠期为12周之前，共32例胎儿染色体常规核型分析证实，其中唐氏综合征11例，18三体综合征10例，13三体综合征2例，先天性卵巢发育不全综合征(也称Turner综合征)(45，XO)8例，克氏综合征(47XXY)1例，检出率提高到100%，假阳性率为0%。2012年，Bianchi等[8]利用大规模平行测序技术在2882例孕妇血浆中进行胎儿染色体非整倍体的检测，发现唐氏综合征灵敏度为100%(89/89)，18三体综合征灵敏度为97.2%(35/36)，13三体灵敏度为78.6%(11/14)，单倍体X灵敏度为93.8%(15/16)；此外，还检测出其他性染色体异常(XXX,XXY,XYY)及常染色体异常2例(16号和20号)，表明孕妇血浆中胎儿DNA检测染色体异常灵敏度和特异度高。2013年，Huang等[9]对189例双胎妊娠孕妇进行母体血浆DNA大规模平行测序，成功检测出9例唐氏综合征和1例18三体综合征，另1例18三体综合征为正常胎和1例18三体综合征胎儿未能检出，检测唐氏综合征的特异度为100%，对胎儿18三体综合征的灵敏度和特异度分别为50%、100%；进一步研究表明，非侵入性产前诊断唐氏综合征的双胎妊娠具有高精确度，可以避免95%的侵入性产前诊断。

2单基因遗传病筛查

单基因遗传病是常见的出生缺陷之一，目前报道可利用孕妇外周血中游离DNA进行父源性致病基因的非侵入性产前诊断。在β珠蛋白合成障碍性贫血的检测中，Galbiati等[10]采用微电子芯片技术对32例孕妇进行诊断，通过检测7个常见的β珠蛋白突变得到100%的准确度和98.3%的特异度。2012年，Sirichotiyakul等[11]利用孕妇血浆中胎儿游离DNA进行实时荧光定量PCR技术，检测α珠蛋白合成障碍性贫血纯合子基因突变，灵敏度为98.4%，假阳性率为20.8%，利用这一技术可以避免79.2%的α珠蛋白合成障碍性贫血纯合子行侵入性产前诊断。在软骨发育不全、肌强直性营养不良、先天性肾上腺皮质增生和囊性纤维化中也有成功检测的报道[12]。

3胎儿性别鉴定

在孕早期通过孕妇外周血中胎儿DNA进行胎儿性别测定对排除性染色体相关疾病有重要意义，如X连锁遗传病，其致病基因在X染色体上，通过性别检测可进一步判定患X连锁遗传病的风险，指导妊娠[5]。1989年，Lo等[2]首次应用巢式PCR技术在怀有男性胎儿的孕妇外周血中扩增出Y染色体的特异性重复序列，并提出这一技术可以作为性相关基因疾病的产前诊断方法之一。Honda等[13]在81例孕妇中得到妊娠5～10周的血清样本，先通过常规PCR检测，检出男性胎儿的总灵敏度为95%，在第7周后灵敏度达100%；后用实时定量PCR检测5周孕龄的胎儿性别，灵敏度也接近100%。2011年，Zargari等[14]从80例妊娠6～10周的孕妇外周血浆中提取胎儿游离DNA，采用巢式PCR技术对男性胎儿Y染色体单拷贝SRY基因、多拷贝DYS14和DAZ基因序列进行检测，灵敏度为95.2%。

4胎儿血型检测

母儿血型不合是我国新生儿溶血性疾病的主要原因。目前临床上主要的诊断方法为夫妇血型检查、血型抗体的测定、超声检查等，但最终确诊尚需待新生儿期的检查。2010年，施选性等[15]用健康孕妇血浆游离DNA检测胎儿ABO血型，在46例样本中，产前检查能正确显示胎儿血型的有38例，总检出率为82.61%；待婴儿出生后血清学检测，总检出符合率81.58%。2011年，马红丽等[16]对139例O型血孕妇外周血DNA检测胎儿血型准确度分析，新生儿出生前后血型检测符合率为94.24%(131/139)，孕中期血型检测符合率为91.95%(80/87)，孕晚期的血型检测符合率为98.08%(51/52)。2011年，Sedrak等[17]对90例RhD阴性孕妇进行研究，通过PCR扩增技术检测RhD基因序列和SRY基因序列诊断胎儿RhD血型和性别，诊断出61例RhD阳性和29例RhD阴性胎儿，其中男37例，女53例；在胎儿RhD血型检测中，妊娠前3个月灵敏度和诊断准确度分别为93.5%和91.1%，到妊娠中期分别增加到100%和97.78%；在胎儿性别鉴定中，妊娠前3个月灵敏度为95.2%，诊断准确度97.87%，到妊娠中期都增加到100%。2013年，Manzanares 等[18]通过定量PCR技术检测8～13周妊娠的RhD阴性孕妇母体血浆中胎儿RhD基因型，与产后脐带血表型进行比较，一致性为98.2%；其中1例假阳性和1例假阴性，检测的特异度和灵敏度分别为97.5%和95%；RhD阴性孕妇在妊娠早期检测可以避免不必要的产前预防。说明在妊娠早期通过孕妇血浆中胎儿游离DNA检测RhD血型是可行的、高度精确的。

5妊娠相关性疾病预测

5.1先兆早产早产儿各器官发育不完善，使其存活率下降，病残率上升，因此有效预测并及时处理早产有重要意义。2012年，Jakobsen等[19]对876例孕妇进行大规模研究，通过筛查检测RhD基因，用一个标准曲线来量化胎儿游离DNA的数量；发现在孕25周左右，体内高水平的胎儿游离DNA与自发性早产风险增加有关，在34周之前的早产，其孕妇外周血浆中的胎儿游离DNA水平升高15倍，认为胎儿游离DNA检测可用来预测自发性早产，作为筛查早产的指标。

5.2妊娠期高血压疾病妊娠期高血压疾病是妊娠与血压升高同时存在的一组疾病，可造成孕产妇和围生儿死亡，但其病因和发病机制尚不明确[5](64-65)。2002年，Lau等[20]通过实时定量PCR技术检测Y染色体上的SRY基因，发现孕妇外周血中胎儿游离DNA的水平在子痫前期组为521 gEq/mL，对照组为227 gEq/mL，差异有统计学意义(P=0.017)；在先兆子痫患者血浆中胎儿游离DNA 的半衰期为114 min，对照组的半衰期为28 min，两者差异有统计学意义(P=0.007)；对照组在产后6 h胎儿游离DNA完全清除，有3例在产后2 h就下降为0 gEq/mL，而在先兆子痫组无产后6 h胎儿游离DNA下降为0 gEq/mL，认为胎儿游离DNA的清除可能与潜在的病理异常(血管病变等)有关。2011年，邬晋芳等[21]应用甲基特异性PCR的原理及荧光定量PCR的方法，检测孕妇外周血中u-maspin基因的含量，发现各孕期基因检出含量差异有统计学意义(P<0.05)；其中中孕是早孕的4.43倍，晚孕是早孕的5.13倍，轻度子痫前期是正常晚孕的2.39倍，重度子痫前期是正常晚孕的5.78倍；由此认为，孕妇外周血中胎儿游离DNA的含量随着孕周的增加而增加，在子痫前期患者中游离DNA含量随着病情的加重而增加。2013年，Zamanpoor等[22]运用实时定量PCR技术检测孕妇外周血浆中Y染色体上的SRY基因水平，进行中期妊娠(13～27周)及晚期妊娠(28～40周)基因水平定量检测对比，发现妊娠期高血压疾病组中期妊娠平均游离DNA水平(6.72 gEq/mL，n=3)较正常妊娠组(8.75 gEq/mL，n=8)低，统计分析差异无统计学意义(P=0.597)；而晚期妊娠平均游离DNA(245.23 gEq/mL，n=16)较正常妊娠组(49.77 gEq/mL，n=30)明显升高(约升高492%)，差异有统计学意义(P=0.001)；由此认为，妊娠期高血压疾病时肝、肾功能受损，影响循环中胎儿DNA的清除。检测孕妇外周血中胎儿游离DNA可以作为潜在的筛查妊娠期高血压疾病的指标。

5.3妊娠期糖尿病妊娠期糖尿病是指在妊娠期首次出现或发现的糖尿病，对母儿都有较大危害[5](75)。近些年发病率有增高趋势，但病因及发病机制尚不明确，因此早期防治十分重要。2010年，汤冬玲[23]用血浆DNA抽提法提取62例妊娠中晚期孕妇外周血中胎儿游离DNA，通过实时荧光定量PCR法检测两组孕妇外周血胎儿DNA8水平；结果显示，妊娠期糖尿病组孕妇外周血中胎儿游离DNA水平(均值212.31±80.95拷贝数/mL，n=32)明显高于正常孕妇组(均值152.08±62.61拷贝数/mL，n=32)，差异有统计学意义(P<0.01)；并且认为，胎儿游离DNA水平的变化可作为辅助诊断及预防妊娠期糖尿病的一项有效指标。而2013年，Zamanpoor等[22]提出了不同的结论，其运用实时定量PCR技术检测孕妇外周血浆中Y染色体上的SRY基因水平，进行中期妊娠(13～27周)及晚期妊娠(28～40周)的基因水平定量检测对比，发现妊娠期糖尿病组中期妊娠平均游离DNA水平(6.09 gEq/mL，n=8)较正常妊娠组(8.75 gEq/mL，n=8)低，晚期妊娠平均游离DNA水平(42.43 gEq/mL，n=32)较正常妊娠组(49.77 gEq/mL，n=30)低，统计分析差异无统计学意义(P=0.400和P=0.621)；认为胎儿游离DNA水平会随着胎龄的增加而增加，在妊娠期糖尿病时胎盘功能改变影响母胎血液循环。两者有着完全不同的结论，因此妊娠期糖尿病方面的临床应用还需进行大样本的数据研究。

6小结

孕妇外周血中胎儿游离DNA作为一种新的生物标志物，在产前诊断及妊娠相关性疾病的防治方面提供了新的思路，被用于预测临床问题，具有诸多优势，但目前仅部分应用于临床实践中。为了进一步广泛临床应用，还需严格的临床论证以及寻找更多的方法，以更好地应用孕妇血浆中胎儿游离DNA来诊断遗传病及妊娠相关性疾病(如稽留流产、死胎等)。近年来，分子生物学技术的快速发展，在孕妇外周血中胎儿游离DNA方面的研究将更加深入，其在产科中的临床应用也将更广。

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摘要：检测孕妇外周血中胎儿游离DNA，为无创产前诊断及妊娠相关性疾病的防治找到了新途径，此种技术具有诸多优势。孕妇外周血中胎儿游离DNA测序可用于胎儿非整倍体疾病、胎儿单基因遗传病、胎儿血型的检测、胎儿性连锁疾病的产前诊断筛查；胎儿游离DNA水平的变化可作为一种新的生物指标为妊娠相关性疾病的诊断及治疗提供帮助。随着分子生物学技术的不断发展，对孕妇外周血中胎儿游离DNA的研究将更加深入。

关键词：胎儿游离DNA；孕妇血浆；产科

The Application of Fetal Cell-Free DNA in Maternal Peripheral Blood in ObstetricsCHENGLi-qin1,TIANChun-fang2.(1.MedicalCollegeofShantouUniversity,Shantou518041,China; 2.DepartmentofGynecologyandObstetrics,ShenzhenSeventhPeople′sHospital，Shenzhen518081,China)

Abstract:The detection of fetal cell-free DNA in maternal peripheral blood has opened up a new avenue of research for noninvasive prenatal diagnosis,prevention and treatment of pregnancy-related diseases,which has many advantages. The sequencing of fetal cell-free DNA in maternal peripheral blood can be used as prenatal disgnosis for fetal aneuploidy diseases and fetal monogenic hereditary diseases,the detection of fetal blood type and prenatal screening and diagnosis of sex-linked disorders.The changes of fetal cell-free DNA level can be used as a new index of clinical diagnosis and treatment on pregnancy related diseases.With the development of molecular biology,the study of fetal cell-free DNA will be deeper.

Key words:Cell-free fetal DNA; Maternal plasma; Obstetrics

收稿日期：2014-06-05修回日期：2014-09-07编辑：郑雪

中图分类号：R711

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)05-0796-03