同位素示踪RRL肿瘤新生血管显像的应用

王荣福

（北京大学 第 一医院，北京 100034）

恶性肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，中国新增307万肿瘤患者，其中约220万人死亡，分别占全球总量的21.9%和26.8%。流行病调查资料发现，在未来的20～30年，我国肿瘤死亡率将继续上升。因此，筛查、预警和肿瘤早期诊断及个性化治疗将成为肿瘤防治中的关键问题。近年来，国家对肿瘤、心脑血管等重大疾病防治高度重视，并投入大量科研基金深入开展肿瘤防治基础与临床研究。

恶性肿瘤组织生物靶向分子功能成像是指以肿瘤实质细胞、肿瘤新生血管内皮细胞膜表面及其内部，细胞外基质选择性表达，正常组织细胞不表达或呈低表达的标记分子为靶点，通过各种不同的示踪方法，标记对靶点有特异选择性亲合作用的配体，应用各有所长的显像技术，达到靶向显示肿瘤组织不同生物学特性的目的。目前，分子功能成像技术以其靶向示踪分子生物学过程的优势已经成为影像技术领域研究的热点。靶向分子功能成像技术的关键是能够找到靶向性好的体内显像配体［1］。

近年来，肿瘤新生血管显像药物的研究从低选择性向高选择性方向发展，典型的例子就是从最初的放射性核素标记大分子蛋白（如单克隆抗体）演变为多肽、蛙皮素（bombesin）、小分子化合物等具有生物活性的小分子配体。小分子标记配体更容易穿透肿瘤组织，因此具有较高的靶器官／非靶器官放射性摄取比和更快的血液清除率，也更具有生物专一性。作为放射性配体，约50个氨基酸以下多肽组成的小分子配体与大分子蛋白相比的优点还表现在：（1）小分子多肽容易通过化学方法合成；（2）能承受修饰或放射性标记过程中苛刻的化学条件；（3）具有更小的免疫原性；（4）可以通过化学方法调控优化多肽与特定结合位点亲和力，并展示较好的特异性分布；（5）大多数情况下具有较好的药动学特征，其中可被靶组织迅速摄取的特点在肿瘤显像中尤其重要。这与单克隆抗体在肿瘤组织较慢甚至较差摄取特点正好相反。因此，经过特定修饰的多肽类似物可克服传统抗体及其片段的不利药动学特点及显像性质，应用前景广阔［2］。

正电子核素标记放射性药物用于PET／CT分子功能显像在临床诊疗疾病过程中发挥重要作用［3］，而小分子多肽探针在肿瘤新生血管显像研究中具有很好的应用前景［4］。小分子多肽结构简单，便于进行化学结构修饰，从而优化其物理化学特性、药效学和药代动力学性能，并提高显像的特异性和灵敏度［5］。另外，由于多肽的相对分子质量一般较小，易与靶点相结合，显像速度快，多肽合成方法简单成熟［6－7］。

目前，靶向多肽分子探针发展最为成熟和迅速，其中研究最多的多肽分子是能够靶向结合于整合素αVβ3受体的精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸序 列 （Ar g-Gly-Asp，RGD）多 肽 分 子 探针［8－9］。由于整合素αVβ3受体在恶性肿瘤新生血管内皮细胞中显著高表达，且与肿瘤的恶性程度及侵袭性密切相关，因此定量示踪整合素αvβ3受体的表达对于恶性肿瘤的早期诊断、抗肿瘤新药的研发及抗癌治疗效果的监测有着重要作用［10－12］。目前，放射性核素18F［13］、68Ga［14］、99mTc［15］、177Lu［16］和64Cu［17］等标记的 RGD 多肽核素单光子发射计算机断层显像（single photon emission computed tomography，SPECT）及正电子发射断层显像（positron emission to mography，PET）已经成为肿瘤新生血管分子功能显像的热点之一［18－19］。但是RGD在肝脏及肾脏的摄取相对较高，并且临床前期实验发现，多肽RGD的结构稳定性欠佳，灵敏度不高［19］。因此，理想的小分子多肽探针的探索和研发十分必要［20］。

1 小分子多肽RRL

2000年，Brown 等［21］应用自行研发的Fli Trx大肠杆菌肽展示文库寻找与肿瘤同源的内皮细胞（t u mor derived endot helial cell，TDEC）特异性表面标志物结合的多肽序列，对所得的5条特异性多肽序列进行了TDEC及成纤维细胞的体外结合实验，将成纤维细胞作为阴性对照组，除多聚赖氨酸序列，其余多肽序列均显示出相同的背景结合。异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）标记的精氨酸-精氨酸－亮氨酸（Ar g-Ar g-Leu，RRL）序列在光学成像实验中显示出最强荧光信号，提示多肽RRL与TDEC结合的量最多，特异性最强。2005年，Weller等［22］将小分子多肽 RRL连接于气体分子微泡（molecular bubble，MB），分别与TDEC和人冠状动脉内皮细胞相结合，人冠状动脉内皮细胞作为正常内皮细胞进行对照，结果发现 MB-RRL在TDEC中的结合量是对照细胞的3～6倍。同时荧光标记的RRL通过尾静脉注射入荷PC3或Clone C肿瘤的裸鼠体内，5 h后处死小鼠，冲洗其血管，取肿瘤组织冷冻切片，行荧光定位观察。在Clone C肿瘤中，可见血管丰富，荧光信号通过RRL定位于内皮层及更深层区域。PC3肿瘤血管相对较少，荧光标记的RRL大多位于内皮层。对 照 肽 （Tyr-Cys-Gly-Gly-Arg-Arg-Leu-Gly-Gly-Cys，GGG）在任何一种荷瘤动物模型肿瘤病灶无聚集信号。11只荷瘤裸鼠通过尾静脉注射 MB-RRL及 MB-GGG（GGG为对照肽），进行时控超声显像，标记多肽RRL气体分子微泡与肿瘤新生血管来源内皮细胞结合量明显超过正常细胞结合量，在体内靶向超声显像过程中，肿瘤组织周围富含血管的区域可以看见明显的分子微泡信号，说明分子气体微泡通过多肽RRL的靶向结合作用聚集于肿瘤组织富含血管区域，证实了靶向气体分子微泡RRL显像肿瘤新生血管的可行性［22］。该研究为肿瘤新生血管的近红外线荧光成像和正电子核素示踪PET显像的多模态分子探针开发研究奠定了实验基础［23］，具有重要的科学意义。

2 同位素示踪RRL

2.1 131I标记RRL

2009年，北京大学第一医院王荣福教授研究团队［24－25］开始重新设计合成了小分子多肽RRL的结构，使其能够用于放射性核素碘的标记，于明明博士在原有RRL结构的氨基端添加一个酪氨酸，设计合成的RRL结构变为Tyr-Cys-Gly-Gly-Arg-Ar g-Leu-Gly-Gly-Cys 而 能够被放射性核素碘标记，此结构已申请专利［26］，RRL合成纯度大于99%。将131I利用氯胺-T法标记于RRL，在20℃、p H＝7.4条件下标记率大于60%，其放化纯度大于95%。核素标记的RRL在体内外稳定性良好，在37℃血浆中放置24 h后其放化纯度仍然大于90%。动物荷瘤模型实验组尾静脉注射131I-RRL和对照组注射131I-GGG，在注射后24 h分别进行SPECT动物显像，可见肿瘤组织和膀胱区域放射性明显聚集，而对照肽只有膀胱区域出现放射性浓聚。实验结果证实131I-RRL对前列腺癌模型鼠有明确的靶向诊断效果，不失为一种理想的肿瘤新生血管显像剂［27］。RRL与肿瘤血管内皮细胞结合的机制目前尚不明确，卢霞等［28］实验研究发现 VEGFR-2是多肽 RRL靶向结合于肿瘤来源血管内皮细胞的可能靶点，体内外实验证实，VEGFR-2不是多肽RRL与肿瘤内皮细胞结合的唯一靶点，荧光标记RRL不仅在VEGFR-2表达量大的肿瘤细胞内聚集，还可以在表达VEGFR-2较少的肿瘤细胞内聚集，即多肽RRL不仅与肿瘤血管靶向结合，还可以与肿瘤实质细胞结合［29］，与现在研究相对成熟的多肽RGD相比优势明显，其作用机制仍然需要进一步研究［30－31］。同位素标记分子探针的生物安全性主要取决于探针的生物毒性及辐射剂量。实验研究已证明了RRL本身不具有细胞毒性，Zhao等［32］探讨肿瘤靶向新生血管的分子探针131I-RRL在人体主要器官内照射吸收剂量及其在日本大耳白兔体内的药代动力学特征，经估算，人体内照射吸收的有效剂量为0.029 3 mSv／MBq。肿瘤SPECT显像清晰，靶／非靶组织放射性摄取比较高。兔药代动力学结果表明，131I-RRL能够多而快且较长时间地结合于靶组织，具有良好的药代动力学特征，是一种有望应用治疗的药物。131I-RRL是一种安全的、有应用价值和潜力的肿瘤放射性内照射靶向治疗探针。

2.2 99 mTc标记RRL

尽管131I标记多肽RRL研究取得了成功，然而放射性核素131I并不是SPECT显像的理想核素，其射线能量较高（364 ke V），物理半衰期较长（8.03 d）。放射性核素99mTc是目前临床应用最为广泛的发射纯光子的单光子核素，其获取简单、物理半衰期短（6 h）、能量（140 ke V）适合SPECT显像，比131I更有临床应用价值［33］。赵倩等［34］成功设计并合成99mTc标记探针，其标记条件相对简单，产物体外稳定性好。新标记探针99mTc-RRL在肝癌动物模型SPECT显像中获得了良好的显像效果，肿瘤组织显像清晰且对比度好，结果表明，99mTc-RRL在原发肿瘤有巨大应用潜力。为了进一步验证其在转移瘤的应用前景，姚宁等［35］建立了三种肺转移瘤动物模型（B16、Hep G2和Hela肿瘤细胞），新型分子探针99mTc-RRL在三种肺转移瘤裸鼠体内生物分布数据显示出良好的肿瘤靶向性，且肿瘤靶／非靶组织摄取比较高；同时三种肺转移瘤裸鼠模型的SPECT获得了良好的显像效果，肿瘤病灶影像清晰，且对比度好。研究结果揭示了新型肿瘤新生血管分子探针99mTc-RRL在肿瘤转移灶的显像中有应用潜力，为99mTc-RRL由实验基础研究向临床应用转化提供了科学依据［36］。

3 应用展望

新型示踪剂 RRL（Tyr-Cys-Gly-Gly-Ar g－Arg-Leu-Gly-Gly-Cys）能够靶向结合肿瘤来源的内皮细胞，显像肿瘤新生血管。近年来随着肿瘤学研究的深入，逐渐认识到肿瘤血管生成在维持肿瘤组织生长、增加其侵袭性及远处转移能力中发挥的重要作用。目前，针对肿瘤血管生成及转移的相关蛋白的研究成为肿瘤研究领域的重要突破点［36］。靶向肿瘤血管诊断、治疗肿瘤的优势在于血管内皮细胞的基因组较为稳定，很少发生突变，而肿瘤细胞本身是不稳定的，因此无论是诊断还是治疗肿瘤，靶向肿瘤血管内皮细胞相对要容易得多。并且一个内皮细胞要饲养数百个肿瘤细胞，针对血管内皮细胞比直接针对肿瘤细胞更为有效。在目前有关肿瘤血管的研究方法中，放射性核素示踪方法在体内应用中具有最高的灵敏性和特异性，而且放射性核素示踪方法简单，便于操作，易于临床应用［37］。目前研究较多的靶向肿瘤新生血管的显像剂有血管内皮生长因子受体显像［38］、整合素αvβ3小分子肽显像［39］及其他肿瘤血管内皮细胞上标志分子显像［40］。

小分子多肽RRL是通过大肠杆菌肽展示文库筛选而来，国内外研究学者通过采用不同的示踪剂标记RRL，证明了RRL能够特异性结合于肿瘤新生血管内皮细胞，其能够应用于放射性核素示踪技术、超声、光学分子功能成像技术，是一种具有良好应用前景的靶向示踪分子。王荣福教授研究团队在前期研究中，研制了多种同位素标记的RRL，并成功证实其在荷瘤裸鼠［27，32，34］及 荷 肺 转 移 瘤 裸 鼠［35］活 体 的 显像效果。姚宁等研究表明，［42］99mTc-RRL的药代动力学符合权重为1／c2的三室模型，组织分布特点理想、无急性毒性作用、无热原，是一种比较理想用于人体的肿瘤分子显像剂。前期研究平台为探针99mTc-RRL，由基础向临床转化提供了大量的实验基础。基于目前PET显像设备的快速发展以及PET／CT融合成像相较于其他单一成像的优势，利用正电子核素18F标记多肽RRL研制PET分子探针成为发展的必然。将医学生物学基础科研成果快速且有效地转化为可在临床实际应用的理论、技术、方法和药物是转化医学的核心［43－44］，必将使肿瘤患者真正的从基础科研工作中获益［45］。王荣福教授研究团队目前正致力于利用18F标记RRL的科研工作，以期待找到合适的放射性核素标记的多肽RRL，实现理论研究向实际临床应用的转化。

［1］ 王荣福.核医学分子靶向诊断与治疗［J］.肿瘤学，2014，20（11）：871-874.

［2］ 施孝金，张永信.18F标记肿瘤显像剂的研究进展［J］.世界临床药物，2009，30（3）：177-180.

［3］ 王荣福.肿瘤正电子药物的现状和展望［J］.核化学与放射化学，2006，28（2）：65-71.

［4］ Lu Xia，Wang Rong Fu.A Concise Review of Current Radiophar maceuticals in Tu mor Angiogenesis Imaging［J］. Current Phar maceutical Design，2012，18（8）：1 032-1 040.

［5］ 赵倩，王飞，王荣福，等.肿瘤血管靶向分子探针131I-RRL的辐射吸收剂量及代谢动力分析［J］.中国影像介入治疗杂志，2014，11（3）：7-11.

［6］ Lu Xia，Yang Ping，Wang Rongf u，et al.The f urther study on radioiodinated peptide Arg-Arg－Leu targeted to neovascularization as well as tu mor cells in molecular tu mor i maging［J］.J Radioanalytical ＆ Nucl Chem，2011，290（3）：623-630.

［7］ 赵倩，李娟，殷雷，等.新型肿瘤新生血管靶向分子探针99mTc-RRL的合成及初步研究［J］.肿瘤学，2013，19（12）：931-935.

［8］ 刘红洁，王荣福，张春丽，等.131I标记RGD环肽在荷瘤小鼠的体内分布与显像研究［J］.中国医学影像技术杂志，2008，24（1）：131-133.

［9］ 张丽，张春丽，王荣福，等.RGD多肽类药物设计、活性测定及99Tcm-c RGD二聚体的制备［J］.核化学与放射化学，2011，33（2）：106-113.

［10］Zhu Z H，Miao W B，Li Q W，et al.（99）mTc-3PRGD2 f or integrin receptor i maging of lung cancer：a multicenter study［J］.J Nucl Med，2012，53（5）：716-722.PMID：22499615.

［11］Shi J，Fan D，Dong C，et al.Anti-tumor effect of integrin targeted177Lu-3PRGD2 and combined therapy with Endostar［J］.Theranostics，2014，4（3）：256-266.PMID：24505234.

［12］崔永刚，张春丽，王荣福，等.131I标记c RGD环肽对荷黑色素瘤小鼠靶向治疗作用［J］.中华核医学杂志，2009，29（2）：92-95.

［13］Li WH，Lang L X，Niu G，et al.N-Succini midyl 4-［18F ］-fluoromethylbenzoate-labeled dimeric RGD peptide for i maging tu mor integrin expression［J］.Amino Acids，2012，43：1 349-1 357.

［14］Paeng J C，Lee Y S，Lee J S，et al.Feasibility and kinetic characteristics of68Ga-NOTA-RGD PET f or in vivo atherosclerosis i maging［J］.Ann Nucl Med，2013，27：847-854.

［15］Bohn P，Modzelewski R，Rouvet J，et al.Biodistribution and i maging of ［99mTc］-HYNICRGD in MDA-MB-231 and NTERA-2 cancer cell xenografts［J］. Nucl Med Communications，2013，34（7）：709-717.

［16］Chakraborty S，Sar ma H D，Vimalnath K V，et al.Tracer level radiochemistry to clinical dose preparation of177Lu-labeled cyclic RGD peptide di mer［J］.Nucl Med ＆ Biol，2013（40）：946-954.

［17］Jytte O，Malene B L，Christina S E，et al.Co mparison of t wo new angiogenesis PET tracers68Ga-NODAGA-E［c（RGDy K）］2 and64Cu-NODAGA-E［c（RGDy K）］2；in vivo i maging studies in hu man xenograft t u mors［J］.Nuclear Medicine and Biology，2014（41）：259-267.

［18］王立正，杨敏.整合素αvβ3受体显像剂18F标记RGD肽的研究进展［J］.同位素，2011，24（增刊）：68-75.

［19］张春丽，杨铭，王荣福.RGD肽与整合素αvβ3受体结合的构效关系及放射性标记配体的设计［J］.肿瘤学杂志，2009，15（1）：76-81.

［20］李玲，张春丽，王荣福.整合素αⅤβ3非肽类小分子拮抗剂的设计及其在肿瘤显像中的研究进展［J］.同位素，2010，23（4）：247-252.

［21］Bro wn C K，Modzelewski R A，Johnson C S，et al.A novel approach f or the identification of unique tu mor vasculature binding peptides using an E.coli peptide display library［J］.Anna Surgical Oncol，2000，7（10）：743-749.

［22］Weller G E，Wong M K，Modzelewski R A，et al.Ultrasonic i maging of tu mor angiogenesis using contrast microbubbles targeted via the tu mor-binding peptide Arginine-Arginine-Leucine［J］.Cancer Research，2005，65（2）：533-539.

［23］Cai W B，Chen K，Li Z B，et al.Dual-f unction probe f or PET and near-infrared fluorescence imaging of tu mor vasculat ure［J］.J Nucl Med，2007，48（11）：1 862-1 870.

［24］Yu M M，Wang R F，Yan P，et al.Design，synthesis and iodination of an Arg-Ar g-Leu peptide f or potential use as an i maging agent f or hu man prostate carcino ma［J］.J Labelled Co mp Radiophar m，2008，51（11／12）：374-378.

［25］王荣福，于明明，闫平，等.碘标记肿瘤血管靶向多肽研究［J］.同位素，2009，22（2）：96-100.

［26］王荣福，于明明，张春丽，等.一种用于肿瘤显像的放射性同位素标记多肽：中国，ZL200810114762.9［P］.2012.

［27］Yu M，Zhou H，Liu X，et al.Study on biodistribution and imaging of radioiodinated argininearginine-leucine peptide in nude mice bearing human prostate carcinoma［J］.Ann Nucl Med，2010，24（1）：13-19.

［28］卢霞，王荣福.肿瘤新生血管显像剂RRL在体内靶向示踪机制研究［J］.肿瘤学杂志，2010，16（6）：449-452.

［29］卢霞，王荣福，张春丽.新型多肽示踪剂131I-RRL肿瘤分子显像研究［J］.同位素，2011，24（3）：177-181.

［30］Lu X，Yan P，Wang R F，et al.Use of radioiodinated peptide Ar g-Arg-Leu tar geted to neovascularization as well as tumor cells in molecular tumor imaging［J］.Chin J Cancer Res，2012，24（1）：52-59.

［31］Lu X，Yan P，Wang R F，et al.The f urther study on radioiodinated peptide Arg-Arg-Leu targeted to neovascularization as well as t u mor cells in molecular tumor i maging［J］.J Radioanalytical＆ Nucl Chemistr y，2011，290（3）：623-630.

［32］Zhao qian，Yan Ping，Wang Rong Fu，et al.Validation study of131I RRL Assess ment of biodistribution，SPECT i maging and radiation dosi metry［J］.Mol Med Report，2013，7（4）：1 355-1 360.

［33］王荣福.核医学［M］.第3版.北京：北京大学医学出版社，2013：3-7.

［34］Zhao Q，Yan P，Wang R F，et al.A Novel99mTc-Labeled Molecular Probe for Tu mor Angiogenesis Imaging in Hepatoma Xenografts Model：A Pilot Study［J］.PLoS ONE，2013，8：e61043.

［35］Yao N，Yan P，Wang R F，et al.Detection of pul monary metastases with the novel radiolabeled molecular probe，99mTc-RRL［J］.Int J Clin Exp Med，2015，8（2）：1 726-1 736.

［35］王荣福.核素示踪精氨酸－精氨酸－亮氨酸在肿瘤新生血管研究中的进展与展望［J］.国际放射医学核医学杂志，2015，39（1）：50-54.

［36］卢霞，王荣福.肿瘤血管靶向分子探针多肽RRL（g2）的作用研究［J］.肿瘤学，2013，19（12）：925-929.

［37］王荣福，王飞，李颖.核医学示踪技术的应用研究［J］.肿瘤学，2015，21（4）：261-263.

［38］Mcder mott U，Pusapati R V，Christensen J G，et al.Acquired resistance of non-s mall cell lung cancer cells to Met kinase inhibition is mediated by a Switch to epider mal growth factor receptor dependency［J］.Cancer Res，2010，70（4）：1 625-1 634.

［39］张春丽，王荣福，张丽，等.靶向整合素α＿vβ＿3受体的新型RGD肽二聚体的～（131）I标记与生物活性的初步评价［J］.北京大学学报（医学版），2011，43（2）：295-300.

［40］卢霞，王荣福，张华北.放射性药物FAK抑制剂靶向肿瘤侵袭力作用研究［J］.肿瘤学，2015，21（4）：264-269.

［41］Yao Ning，Chen Que-qi，Wang Rong-f u.Application Progress of Nano-material in Molecule Functional Imaging with Radionuclide Tracing Technique and Targeted Treat ment［J］.J Mol Biol Techniques，2014，1（1）：1-5.

［42］姚宁，王荣福，闫平，等.新型探针99mTc-RRL的药代动力学与急性毒性研究［J］.中国临床药理杂志，2015，31（5）：285-290.

［43］钟南山.中国临床医生转化医学实践之路［J］.中国实用内科杂志，2012，32（7）：481-483.

［44］崔志文，夏烨，孙小娟，等.国内外转化医学发展历程与展望［J］.生命科学，2012，24（4）：316-320.

［45］Shastry B S.Phamacogenetics and the concept of individualized medicine［J］.Phamacogeno m ics J，2006，6（1）：16-21.