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植物SSR分子标记技术的应用

2015-02-10何,辛

天津农林科技 2015年5期
关键词:微卫星多态性基因组

刘 何,辛 艳

(天津市种子管理站,天津 300060)

植物SSR分子标记技术的应用

刘何,辛艳

(天津市种子管理站,天津 300060)

目前,植物基因组学研究中SSR标记的应用较为活跃。该种标记具有近于均匀覆盖基因组、多态性高等优点,在植物高密度遗传图谱绘制、DNA指纹图谱构建、种系纯度与亲缘关系鉴定以及植物遗传进化方面具有公认的优越性。不足之处在于位点特异性SSR标记的建立先要根据微卫星侧翼序列进行引物设计,所以引物的高开发成本一直是非商业化物种SSR标记遗传研究的主要障碍,而且很多根据检索得到的引物的多态性效果不佳,因此寻找一种快速廉价的引物筛选方法已成为SSR应用的热点问题。这几年开发出了多种基于SSR标记的方法,如ISSR、SAMPL等。

简单序列重复;微卫星;DNA标记;植物育种

植物相关的简单序列重复(Simple Sequence Repeats, SSR)标记技术已用于小麦、水稻、大豆等主要大田作物和油菜、甘蓝、黄瓜等多种园艺植物的基因组学研究[1-2],该技术在植物高密度遗传图谱绘制、目的基因定位、指纹图谱构建、种系纯度检验及植物遗传进化研究等方面有公认的优越性[3-5]。

1 DNA分子标记

分子水平的遗传标记是以DNA、蛋白质等生物大分子多态性(指序列、结构等特征存在多种形式)为基础的标记。而DNA标记是因DNA发生缺失、插入、易位、倒位或由于存在长短与排列不一的重复序列等机制而产生的多态性标记。具有可遗传、可识别性,可以是某个结构基因的一部分或是DNA非编码区序列[1],亦或是经限制性酶切处理产生的多态性DNA酶切片断形式。

DNA分子标记较其他标记形式的优点是:(1)基于DNA水平检测,能揭示物种本质而不受个体发育水平和环境条件干扰;(2)数量众多,遍布于整个基因组,编码区与非编码区序列都可作为标记,另外,DNA标记利用基因组变异检测的结果具有较高多态性,克服了单纯利用基因标记的缺点,扩增片段长度多态性(AFLP)、单核苷酸多态性(SNP)都基于DNA的点突变检测[6-7],SSR标记能检测到较高的单基因座位多态性[8];(3)许多标记表现共显性遗传,可区分个体的纯合性与杂和性[1]。

2 SSR标记技术

2.1SSR的构成

SSR的发现最初始于动物基因组[4]。之后,人们发现几乎所有真核基因组中都存在重复序列(现在细菌DNA中也有发现[9],也称卫星DNA[10],DNA复性动力学进一步证明这类序列往往由大的重复单位嵌套若干小的乃至更小的串联重复单位构成。依据这些单位的重复程度,进一步分为轻度重复序列、中度重复序列和高度重复序列[11]。

高度重复序列是简单重复单元的高度重复形式,重复序列的单位长度可以为1~6个核苷酸[1,9],重复次数可从几百次到几百万次拷贝数,所以也称为微卫星DNA(microsatellite DNA)[11]或短的串联重复序列(Short Tandemly Repeats,STRs)[12]。已知微卫星序列的重复形式多样,在基因组中近于均匀分布,其分布情况与基因组大小有关[9],果蝇染色体着丝点附近的微卫星有ACAAACT、ATAAACT、ACAAAATT等形式,拷贝数分别达1.1×107,3.6×107,3.6×107[11]。Skinner等在寄居蟹基因组中发现一种微卫星形式为(TAGG)n[12]。植物中通过对拟南芥、小麦、水稻等研究,证明SSR在基因组中含量很丰富,已发现的微卫星有(CA)n,(AT)n,(GC)n,(GATA)n,等等,其重复次数多在10~60之间[6]。最常见的为双核苷酸重复(GA)n,(AC)n是小麦和水稻中最普遍的双核苷酸重复形式。小麦中(AC)n拷贝数达3 000,(GA)n重复次数在6 000以上;水稻中(AC)n与(GA)n重复次数分别达1 000 和2 000以上。栽培型花生中常见的是(GA)n微卫星[13]。植物中存在的三核苷酸重复、四核苷酸重复单位常见的有(AAG)n、(AAT)n,双子叶与单子叶植物的微卫星数量、分布都是不同的。植物叶绿体中也发现微卫星的存在[6]。Toth等已对大量微卫星类型及分布情况作了较细致的总结[9]。

由于SSR重复单位的差异,人们把微卫星分为核心区(Core Sequences)与两侧的侧翼序列。核心区由短的重复单位组成,每个单位的碱基数目一般不变。重复次数是高度变异的,不同个体可能差别很大,所以又称为串联重复数目变异(VNTR)多态性。通过评估VNTR的差异可实现对个体的识别[14]。根据重复单位的排列方式,Weber等将核心区分为完全型(Perfect)、不完全型(Imperfect)和复合型(Compound)。完全型微卫星是由不中断的重复单位构成的;不完全型其重复序列中间有3个以下的非重复碱基,两侧不中断的部分重复数大于3;复合型指两类或两类以上的串联重复单位由3个连续的非重复碱基分隔开,但不中断的重复单位的重复数不小于5[4]。核心区两侧为侧翼区,其突变少,一般是单拷贝的结构基因区。Toth等[9]报道真核基因组中位于内元(ntron)、基因间隔区(Intergenic Region)等非编码区中的SSR要多于功能基因区中的SSR,所以SSR与功能基因可能存在遗传连锁关系[5,15]。

关于SSR高变异性,目前主要有两种假说:DNA聚合酶滑动错配假说和不均等重组假说[9,11]。

SSR对于调节转录活性、保护DNA完整性、特殊转录因子编码、基因重组与基因组进化有特殊意义[4,9]。

2.2SSR标记

微卫星的VNTR特性与高度变异易于形成多位点多态性或亲子代特异性位点的多态性,通过这些不同的变异就可发现不同的SSR在不同种间甚至于不同个体间的差异。Jeffreys最初就提出利用真核DNA中的小卫星串联重复序列来预测个体的特异性[14]。另外,根据SSR与结构基因的关系,使得SSR对于QTL定位、高密度遗传图谱构建都有重要帮助。范云六等[16]用微卫星标记结合分离群体分组分析把R55小麦中的抗条锈病基因定位在染色体1BS上,证实该抗病基因来自圆锥小麦。刘亚萍等[17]用两对引物定位了小麦抗条锈病基因Yr24,确定了其与SSR位点间的遗传距离。

SSR标记的基本原理为将生物个体微卫星侧翼序列DNA片断克隆、测序,根据侧翼序列人工合成引物进行PCR扩增,将单个座位的微卫星扩增出来,产物具有简单序列重复长度多态性(SSLP),每一扩增位点代表该位点上的一对等位基因,通过高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳来区分该多态性。非特异性SSR标记是利用核心序列制成的1个,2个或3个碱基组成的各10,15,30等次数的寡聚DNA探针与基因组文库杂交,进行检测,经Southern杂交,放射自显影等步骤得到DNA指纹,实现对品系纯度鉴定、杂交优势预测等研究[15],由于其简便易行,分析迅速,在实际中有广泛应用[17]。但该法不能确定单个位点的在基因组上的位置,不能用于基因定位研究且产生的谱带过多,也不利于用计算机数据库进行统计分析[14]。随着毛细管电泳(Capillary Electrophoresis, CE)、多重PCR荧光标记基因组扫描等新技术应用,SSR标记分析将更加快速便捷,同时检测通量将大大提高。

SSR标记的优点在于:数量丰富,近于均匀覆盖整个基因组,揭示的多态性高,尤其适于水稻[1]、花生、小麦[3]、黄瓜[2]等特殊基因组的检测;共显性遗传;样品DNA取样少;另外每个位点由设计的引物顺序决定,便于不同的实验室相互交流合作开发引物。正因如此,我国农业部主管机构已经组织全国重点科研机构制定了针对玉米、水稻、棉花等多种农作物品种的SSR检测技术的行业标准或国家标准并预计于2015推出新版标准及CE检测平台的全国统一的数据检索信息库以整合各地得出的试验数据。

2.2.1SSR标记的开发

SSR标记基于PCR反应,引物的准确程度对于检测结果非常重要[18]。位点特异性SSR标记的建立先要构建基因组文库,并根据微卫星侧翼序列进行引物设计[4,19],所以高开发成本一直是非商业化物种常规SSR标记研究应用的主要障碍[5]。寻找快速廉价的引物筛选方法是SSR应用的重点问题[12]。

常规标记筛选法是酶切基因组DNA,构建小片断基因组文库,用合成的探针与文库杂交鉴定微卫星序列[3],然后进行阳性克隆的测序与引物设计,所设计的引物必须经过PCR并在对应克隆和基因组DNA中扩增出预计产物,工作量相当大。McFadden等[4]利用常规法筛选出甘蓝型油菜基因组文库,对获得的140个阳性克隆进行测序,设计了21对引物,有17对得到理想产物,13对引物扩增产物表现为多态性。Marion S.等从六倍体面包小麦基因组中开发出230对引物,扩增出279个微卫星位点,有20%的标记检测到1个以上的位点[3]。

引物的获得也可由相关文献[16]或DNA数据库如EMBL、GenBank上进行检测[17],大多数农作物都可找到对应SSR引物。但实际检测效果证明此类引物的检测效果往往不如用基因组筛选获得引物的多态性好,例如从EST获得SSR的多态性为54%;而基因组筛选得到的SSR引物多态性达到83.8%[4]。沈金雄等[20]报道根据检索的196对引物,有75对可筛选出产物,其中仅40对能检测出1个位点,最多可检测出5个位点;一般需要2~3对引物才能把亲本材料区分开。

总的看来,SSR标记检测的不足在于引物的开发,另外与AFLP相比,SSR座位突变率高,容易受到趋同变异引起的平行演化的影响,可能给亲缘关系评估带来误差,SSR分析的结果也与植物遗传背景密切相关。

2.2.2SSR标记技术的发展

近几年已开发出多种基于SSR标记的方法。简单重复间序列(Inter-Simple Sequence Repeat,ISSR),也称锚定SSR(anchored simple sequence repeats)[21],是直接利用被标记的SSR引物,扩增SSR间的单拷贝序列。引物设计时在5'端和3'端分别加上1-2个选择性碱基,使得退火温度提高,引物有更强的专一性,降低了杂带的干扰,增加了扩增特异性和试验结果可重复性[1]。ISSR引物的开发不需对侧翼序列单独测序,开发费用降低[2],它结合了RAPD与SSR的优点,耗资更少。其引物可以在不同的物种间通用而不像SSR标记一样有较强的物种特异性;与RAPD和RFLP相比,ISSR揭示的多态性较高,可获得几倍于RAPD的信息量,精确度几乎可与RFLP相媲美[1,19]。ISSR广泛应用于多种植物的指纹图谱绘制。Prevol等[1]用4 个ISSR标记对34个马铃薯品种检测,有两个引物完全可以将这些品种区分开。Ammiraju等[19]通过ISSR技术已找到与小麦籽粒大小相关的QTL。

选择性扩增微卫星多态性位点(Selective Amplification of Microsatellite Polymorphism Loci,SAMPL)是SSR与AFLP相结合的分子标记。它利用微卫星序列设计引物,不需预先对微卫星位点进行克隆和测序。方法是在AFLP反应的第二次扩增时将一个具有3个选择性碱基的AFLP引物与一个16-18 bp的人工SAMPL引物组合在一起,由于SAMPL引物的特异性[12,19],在扩增时,SAMPL引物5'端重复提供进行严格复性的5'端锚定位点,因而该引物的3'端的第二个微卫星就可延伸。根据不同的限制性内切酶、SSR引物及选择性接头引物的组合,SAMPL所揭示的多态性几乎是无限的。与其他方法相比,其结果可能最有价值[5,15]。另外还有RAPD与SSR结合的随机扩增微卫星多态性法等等。

3 SSR标记应用

微卫星标记广泛用于重要性状基因定位及分子标记辅助育种研究。已利用微卫星标记建立了与水稻抗白枯病基因、蜡质基因,大豆抗条纹花叶病和大豆开花期基因连锁的微卫星标记[1]。亲缘关系鉴定方面,Manifesto等对105份小麦品种用位于不同染色体上的探针检测后发现亲缘关系越近的品种,指纹谱的相关系数越高。郭旺珍等用SSR标记对棉属二倍体及四倍体种进行遗传多样性分析,揭示出属于D染色体组的拟似棉与其他D染色体组棉种的相似系数最低,A、D染色体组间相似系数很高[22]。韩丽娟等[23]在大豆疫霉菌研究中指出应用SSR标记确定生理小种间亲缘关系是可行的。Pestson等利用18对微卫星标记对113份二倍体粗山羊草进行分析,认为微卫星标记非常适于遗传多样性分析。Diwan等[1]用20个SSR位点成功地将17个用AFLP未能完全区分开来的栽培大豆分开。Weising等认为对于品种鉴别来说,SSR标记比RAPD等标记更加优越,获得的资料便于在不同实验室间共享。

由于PCR-SSR标记法比RFLP更易操作和宜于实现自动化,所以利用很少的微卫星即可进行遗传多样性分析及系统进化研究。Peil等用该标记鉴定了普通小麦种间的代换系。而Procunier等鉴定了四倍体小麦的异附加系。值得注意的是有些微卫星虽然是位点特异性的,但并不具备相应的部分同源性,与RFLP相比,所揭示的部分同源性是很低,因而在染色体的部分同源性鉴定及比较作图中的应用受到了一定限制。

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Q78

A

1002-0659(2015)05-0034-04

2015-07-08

天津市农业局青年人才培育项目(201306)

主要作者简介:刘何(1978-),男,农艺师,主要从事种子质量检验工作。E-mail:23120207@qq.com

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