基因诊断技术及其临床应用

李姗珊(综述)，焦　娟(审校)

(北京军区总医院检验科，北京 100700)

基因诊断技术及其临床应用

李姗珊(综述)，焦娟※(审校)

(北京军区总医院检验科，北京 100700)

摘要：基因诊断技术是传统诊断技术的一个有效补充，其可以在基因水平上对疾病进行预测、防治和诊断。其主要通过分子生物学方法对患者体内的遗传物质结构和表达水平进行检测，对相应的基因进行突变分析，以达到诊断特定疾病的目的。目前基因诊断技术已在临床多个领域广泛应用。该文就目前基因诊断中常用的分子生物学技术原理和特点进行概述，并详细介绍基因诊断技术在遗传性疾病、感染性疾病、癌症和血液病中的临床应用情况。

关键词：基因诊断；聚合酶链反应；临床应用

基因诊断是指利用分子生物学方法，从DNA或RNA水平检测患者体内基因存在和表达状态，分析基因结构变异情况，进而对疾病作出诊断的方法和过程。基因诊断建立在分子生物学理论和技术高速发展的基础之上，被称之为继临床诊断、生物化学诊断以及免疫学诊断之后的第4代诊断技术。目前认为，一切疾病均可以在基因水平找到答案，通过基因诊断技术对相应基因进行检测，可达到早检测、早预防、早发现、早治疗的目的，这是因为其相对于传统诊断技术具有特异性强、灵敏度高、诊断范围广等优点，并且可以进行直接和早期诊断。基因诊断具有较强的特异性和灵敏性，因此可直接对个体的基因状态进行检测，达到对表型正常的携带者或特定疾病的易感者作出诊断和预测的目的[1-2]。现就基因诊断中常用的分子生物学技术及其临床应用进行综述。

1基因诊断技术

1.1分子杂交技术分子杂交技术又被称为核酸分子杂交技术，其基本原理是将具有同源性的两条核酸单链在一定条件下(适当的温度和离子强度等)按碱基互补原则退火形成异质双链。根据检测样品不同可分为DNA印迹杂交、RNA印迹杂交、点杂交(Dot杂交)和原位杂交。DNA印迹杂交和RNA印迹杂交具有高度特异性和灵敏性，常用于特定基因的定量和定性检测、基因突变分析以及疾病诊断等。Dot杂交用于检测样品中是否存在特异的DNA或RNA，可得到半定量结果。Dot杂交具有简便、快速、经济等优点，是基因诊断常用方法之一。原位杂交可确定探针的互补序列在胞内的空间位置，因此具有重要的生物学和病理学意义。此外，原位杂交还可显示病原微生物存在的方式和部位。目前，基于分子杂交技术的原理又发展出多种新技术，如荧光原位杂交、多色荧光原位杂交和比较基因组杂交等。分子杂交技术被广泛应用于对遗传病、癌症及感染性疾病的诊断[3]。

1.2聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术PCR诞生于1985年，其是一种模拟天然DNA复制过程的体外扩增法。首先通过高温(90～96 ℃)将双链DNA变性，即将双链DNA解螺旋为单链DNA；再以此单链DNA为模板，将温度降至50～60 ℃，以便引物与模板DNA碱基互补配对结合；然后在70～75 ℃条件下，在DNA聚合酶的参与下，以dNTP为原料，根据碱基互补配对原则合成一条新链。如此循环将目的基因迅速扩增。利用PCR技术可将任意目的基因在体外进行特异性扩增。随着RCR技术的不断成熟和发展，在其基础上衍生出多种类型的PCR技术，如热启动PCR、巢式PCR、实时荧光定量PCR等。PCR技术与其他技术的结合使其应用性得到更广泛的发展，目前PCR技术主要用于基因缺失或点突变所致疾病的检测[4]以及病原微生物的检测。

2000年日本学者研发出一种新的核苷酸扩增技术——环介导等温扩增法，与常规PCR相比，其操作步骤更为简单，具有灵敏度高、特异性强等优点[5]。目前该技术已被广泛应用于生命科学领域，在临床检验中主要用于病原体感染方面的检测。

1.3DNA测序技术DNA测序是进行突变分析最重要、最直接的方法，其不受其他筛选方法敏感性和特异性的限制。DNA测序方法主要包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学裂解法，前者更为常用。Sanger双脱氧链终止法的原理是利用DNA聚合酶将结合在待定序列模板上的引物延伸，反应池中包含4种碱基，并混入一定量的双脱氧核苷酸，当双脱氧核苷酸结合到新合成的DNA上，即可终止DNA链的延伸，进而产生长度不等的DNA片段，再由高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。由于双脱氧核苷酸上标记有同位素，因而可采取放射自显影读取结果。现在的直接测序法采用四色荧光标记代替放射性同位素标记，避免了放射伤害，测序自动化程度大为提高，操作更加简便[6]。

1.4基因芯片技术基因芯片技术是将许多特定的基因片段有规律地排列并固定于支持物上，形成储存有大量信息的DNA阵列，然后与待测的标记样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱，获得样品的分子数量和序列信息，进而对基因序列及功能进行大规模、高通量、平行化及集约化的处理和研究。基因芯片技术的出现使对遗传信息进行高效、快速的分析成为可能[7]。基因芯片技术具有快速、简便、高灵敏性和准确性的特点，最重要的是其还可以同时对多种疾病进行检测，便于临床医师了解患者整体的患病情况。

1.5免疫组织化学技术免疫组织化学又称为免疫细胞化学，其是利用抗原与抗体特异性结合的特性，将特异性抗体用显色剂标记，根据抗原抗体结合反应和化学呈色反应对组织或细胞中的相应抗原进行定位、定性和定量检测的一项技术。目前常用的免疫组织化学方法有免疫荧光细胞化学技术、免疫酶细胞化学技术和免疫胶体金技术。由于免疫组织化学技术具有快速、简便、定位准确和特异性强等优点，目前广泛应用于病原体检测、肿瘤病理学检测、肾活检、自身抗体检测及传染病的快速诊断[8]。

2基因诊断技术的临床应用

2.1在遗传性疾病中的应用基因诊断是基于分子遗传学发展而来的，因此其在遗传性疾病的诊断及预测方面的表现尤为突出，其对已明确致病基因的遗传病有较好的诊断效果。基因诊断可在疾病发生和发展的不同层面、不同阶段进行诊断。首先可进行临床症状基因诊断，即医师根据就诊患者的病史、临床症状，为明确或排除某一疾病而进行的检查，如珠蛋白生成障碍性贫血的基因诊断[9]、苯丙酮尿的诊断[10]等。临床基因诊断一般不难，但临床意义也有限。症状前基因诊断主要用于遗传病家系或有遗传病倾向的家系中未发病但有高度发病风险人群的诊断，其对早期诊断后可实施预防性干预措施，进而避免出现严重不良后果的疾病有重要意义，如对导致药物性耳聋的相关基因进行检测，早期预防，可避免药物性耳聋的发生[11-12]。遗传性疾病最可怕之处在于其可以影响下一代，因而通过基因诊断预测子代的基因状态，在必要时进行干预，避免有重大基因缺陷的胎儿出生。这种针对胎儿进行的诊断又分为产前基因诊断和胚胎植入前遗传学诊断。产前基因诊断主要是针对有生育患儿风险的夫妇的胎儿进行的诊断，采用的标本常为绒毛膜标本和羊水标本。这两种标本的采集方式具有一定的创伤性，对母婴的伤害很难避免。近年来，随着科学技术的发展，孕妇外周血中的胎儿有核细胞或游离胎儿DNA含量已满足检测要求，因此可采用孕妇外周血进行产前基因诊断，有效避免了对母婴的伤害。胚胎植入前遗传学诊断是在受精卵分裂至6～8个细胞的卵裂球阶段，取其中1～2 个细胞进行基因诊断，挑选正常胚胎植入母体[13-14]。

2.2在感染性疾病中的应用感染性疾病是病原微生物侵入机体导致的，因此可针对各病原体的特异和保守序列设计引物。对病原体的DNA采用PCR技术直接检测，针对RNA病毒，则可采用实时荧光定量PCR技术得以实现。目前已获得部分病原微生物的全部基因序列，因此，将某种病原微生物的特异保守序列集成排列在一块芯片上，可高效、快速、准确地检测出致病病原体，从而对疾病做出诊断。另外，某些特定基因的存在或基因突变可使机体对某些病毒或细菌等病原体的易患性增加。因此，一旦确定易患基因的存在，及早对高危人群采取预防措施或医疗干预可有效降低机体的感染率。基因诊断具有简便、快速、特异及敏感的优点，目前已在病毒、细菌、衣原体、支原体、立克次体及寄生虫感染的早期诊断中得到应用[2]。目前已知的与疾病感染相关的病原微生物几乎都已建立了相应的PCR检测方法[15-16]，其原理是通过设计特异的引物对病原微生物的目标基因进行扩增，或对细菌的18S rRNA、真菌的28S rRNA进行检测，以达到鉴定病原微生物的目的。与传统的细菌培养鉴定方法相比此方法具有耗时短、敏感性和特异性高的优点。除此之外，环介导等温扩增技术也被广泛应用于各种病原体的检测，随着该技术的完善，目前已成功用于非典型性呼吸综合征、禽流感、人类免疫缺陷病毒、疟疾、弓形虫等疾病病原体和寄生虫等方面的检测[17-20]。

基因诊断技术也可用于感染性疾病病原菌耐药基因的检测。病原菌的耐药问题是临床面临的难题之一，如果能及时检测病原菌的耐药基因，规避耐药药物，选择敏感或相对敏感的药物进行治疗会达到事半功倍的效果，如乙型肝炎耐药基因序列检测和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测等[21]。

2.3在癌症疾病中的应用癌症的发展过程极为复杂，临床表现多样，其发生与多种因素有关，并且在发展过程中涉及多个基因的变化，因而癌症属于多基因病。由于癌症的发生和发展主要基于基因的变化，因此基因诊断在癌症中有广阔的应用前景。目前已发现多种与肿瘤发生相关的癌基因和抑癌基因，而且这些基因的突变常发生在临床症状出现之前。因此通过对相关基因的检测可以达到早预防和早诊断的目的。另外，基因诊断可对肿瘤进行分级、分期及判断预后，也可对微小病灶、转移灶及血中残留癌细胞进行识别检测，并对治疗效果进行评价。检查癌基因的变化不仅有助于肿瘤的诊断和预后判断，而且还可辅助判断手术中肿瘤切除是否彻底、有无周围淋巴结转移等[22-24]。

2.4在血液病中的应用血液病主要包括白血病和血友病。目前研究结果显示，白血病的病因主要是白血病细胞中存在某些特定的融合基因或基因重排[25]，不同的白血病类型其融合基因不同，因而对融合基因或基因重排进行检测，可对白血病进行分型，为白血病的治疗提供有效的分子靶标。血友病A为X连锁隐形遗传性出血性疾病，是凝血因子Ⅷ基因缺陷引起的，通过基因诊断技术可有效地筛查出基因缺陷的携带者，并为产前诊断提供有效的诊断依据[26]。

3小结

随着科技的发展和研究的日益成熟，越来越多的基因诊断方法开始从单纯的实验研究走向临床应用，但该过程也不可避免地存在一些问题。首先，基因诊断技术的标准化问题。目前尚缺乏标准化的操作规程和质量认证体系，标准不统一，质量难保证。其次，基因诊断过程中涉及的伦理学问题及所用资源及信息的安全性问题[27]。尽管基因诊断还存在诸多问题，但是伴随着新技术的日益成熟和发展，其在人类医学领域中的应用将更加广泛。

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Progress in Clinical Application of Gene DiagnosisLIShan-shan,JIAOJuan.(DepartmentofClinicalLaboratory,BeijingMilitaryCommandGeneralHospitalofPLA,Beijing100700,China)

Abstract:Gene diagnosis technique is an effective supplement to the traditional diagnosis technology,which can predict,prevent and diagnose diseases on gene level.Gene diagnosis technique uses molecular biological methods to detect the structure and expression levels of genetic material,and analyze the corresponding gene mutation,in order to achieve the diagnosis of specific diseases.At present,gene diagnosis technology has been widely used in clinical fields.Here summarizes the present principles and characteristics of molecular biology techniques used in gene diagnosis,and introduces the clinical application of gene diagnosis in genetic diseases,infectious diseases,cancer and blood diseases.

Key words:Gene diagnosis; Polymerase chain reaction; Clinical application

收稿日期：2015-04-21修回日期：2015-07-05编辑：辛欣

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.17.047

中图分类号：Q789

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)17-3198-03