寻找受体分子研究方法的进展

张　勇，张　君，雒真龙，姜毅楠，杨　超，杜潇潇(综述)，陈忠华，周鸿敏(审校)

(　1.华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所 教育部器官移植重点实验室 卫生部器官移植重点实验室，武汉 430030；

2.湖北省宜昌市夷陵医院普通外科，湖北 宜昌 443100； 3.华中科技大学同济医学院附属同济医院心胸外科，武汉 430030)

寻找受体分子研究方法的进展

张勇1△，张君2，雒真龙3，姜毅楠1△，杨超1△，杜潇潇1△(综述)，陈忠华1※，周鸿敏3(审校)

(1.华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所 教育部器官移植重点实验室 卫生部器官移植重点实验室，武汉 430030；

2.湖北省宜昌市夷陵医院普通外科，湖北 宜昌 443100； 3.华中科技大学同济医学院附属同济医院心胸外科，武汉 430030)

摘要：配体与受体间的识别及相互作用是分子发挥其功能的重要途径，具有重要的生物学意义。但是，寻找某一分子的受体并不容易，往往成为研究的瓶颈所在。目前寻找及验证某一对配体/受体分子及其对应关系的方法有很多，包括免疫共沉淀、噬菌体展示、酵母双杂交、分子模拟、谷胱甘肽巯基转移酶pull-down、串联亲和纯化等。该文对这些方法的基本原理、简要步骤及优缺点进行综述，为相关研究提供依据。

关键词：免疫共沉淀；噬菌体展示；酵母双杂交；分子模拟；串联亲和纯化

受体是一类存在于细胞膜或细胞内的特异性化学分子，绝大多数是蛋白质；其能特异性识别并结合胞外信号分子，进而激活胞内一系列生理生化反应，使细胞对外界刺激产生相应的效应[1]。配体和相应受体的结合已经成为生命科学研究的热点，一种配体可以通过作用于不同的受体蛋白产生不同的生物学效应[2]。阐明与某种配体特异结合的各种受体蛋白的化学本质、基本结构和生物学特性就很有必要。受体作为生命活动的直接参与者，了解其功能特性就成为揭开生命科学中诸多奥秘的重要步骤[3]。现就免疫共沉淀、噬菌体展示、酵母双杂交、分子模拟、谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase,GST)pull-down、串联亲和纯化(trandem affinity purification,TAP)等研究方法进行综述。

1免疫共沉淀

免疫共沉淀是一种较早用于研究蛋白质之间相互作用的经典方法，它是利用抗原抗体之间专一性结合为基础，以确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法，具有特异性强的特点[4]。用非变性的方法裂解活的细胞时，细胞内存在的许多完整的蛋白质-蛋白质间相互作用的结合体被保留了下来，如果用已知配体蛋白的抗体免疫沉淀该配体蛋白，那么与配体蛋白在体内结合的相应的受体蛋白也能一同被沉淀下来[5]。此法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内发生了结合反应。上述的受体蛋白通过沉淀、洗脱，从而得到分离纯化，纯化后的蛋白质样品可以通过二维凝胶电泳进一步分离；通常二维电泳的第一维电泳是等点聚焦，蛋白质根据其不同的等电点从而在凝胶管中分离，而后将其从凝胶管中完整取出，用十二烷基磺酸钠的缓冲液处理30 min，使十二烷基磺酸钠和凝胶中的蛋白质充分混合；将处理过的凝胶条放在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的琼脂糖溶液使其固定并与浓缩胶连接；在第二维电泳过程中，结合十二烷基磺酸钠的蛋白质从等电聚焦凝胶中进入十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，在浓缩胶中被浓缩，在分离胶中依据其相对分子质量大小被分离；经过二维电泳分离后的蛋白质样品再经过蛋白质谱分析(如肽质谱指纹)进而得到受体蛋白的化学本质[5]。免疫共沉淀是一种经典的研究蛋白质间相互作用的方法，不仅可用于受体配体间的研究，还可用于其他蛋白之间相互作用的研究(如肿瘤的异质性、病毒的侵袭及两种蛋白质相互作用的验证等)[6]。免疫共沉淀有其特有的优点：①相互作用的蛋白质都是活细胞的天然表达产物；②相互作用的蛋白都是在细胞核、细胞质或者细胞壁等稳定的环境下发生的反应，可以避免因人为因素而导致对反应条件的影响；③通过最后的沉淀反应可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物，以便进一步分离、纯化和鉴定新的目标蛋白[7]。但是，该方法也有其不足之处：①低亲和力的以及瞬间相互作用的蛋白可能因为实验条件的限制(如无法捕捉微观分子间每一瞬间动态结合的变化)，从而检测不到实际上已经发生相互作用的蛋白；②由于分子间作用的网络性、复杂性，两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；③不适合用于大规模蛋白质相互作用的筛查，如用Western blot检验，须在实验前预测目的蛋白，以选择最后检测的抗体，在人类10万种蛋白质中，这无异于大海捞针[7]。

2噬菌体展示

噬菌体展示是20世纪80年代发展起来并得到广泛应用的新技术。1985年，有学者首次提出噬菌体展示技术，他将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ中，使外源基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面[8]。噬菌体展示是一种能快速淘选出与靶分子特异性结合配体的高通量选择技术[9]。其基本原理是：以噬菌体为载体，将外源基因插入到噬菌体衣壳蛋白基因中，并组装出具有扩增能力的噬菌体，且在其表面无缺损表达这一外源性蛋白-衣壳蛋白融合体的选择技术[10]。展示于噬菌体表面的外源蛋白或多肽有独立的空间结构和生物活性，通过筛选，得到表达有特异外源蛋白的重组噬菌体，然后进行DNA测序，并可以将筛选出的噬菌体扩增繁殖，进而得到大量富集的所需融合蛋白[9]。建立噬菌体肽库有两种方法：①有机合成法，体外人工合成各种随机序列的核苷酸链，然后插入到噬菌体的基因中，从而得到表达；②基因工程法，外源蛋白或者多肽表达于噬菌体表面后，可以通过固相包被后洗脱或者液相孵育后沉淀等方法筛选与配体结合的特异外源蛋白，经过3~4次筛选后扩增噬菌体，经过DNA测序分析即可得到目的蛋白或者多肽[8]。展示在噬菌体表面的多肽不能太长，一般为20~30个，因为太长会影响噬菌体的感染能力，所得到的目的多肽还只是最终可能受体蛋白的一小部分，可以通过蛋白质组学分析出可能的受体蛋白，然后可以通过一些其他方法来验证[11]。通过噬菌体展示的方法寻找受体蛋白有许多独特的优点：①能对较大的文库进行快速筛选，是一种高通量淘选技术，效率高；②被筛选出的噬菌体还可通过扩增繁殖得到大量目的蛋白多肽，有效避免了检测时的灵敏度问题；③可以进行多次淘选得到高亲和力的多肽序列，从而得到特异度高的受体蛋白；缺点有：①载体的容量较小；②展示的多肽片段小，不能直接得到相应的受体蛋白[12]。

3GST pull-down

GST pull-down是利用GST融合标签纯化出GST融合蛋白[13]。GST pull-down是在1988年开始发展起来的，现已成为一种热门的研究方法[14]。GST pull-down的基本原理是利用重组技术将配体蛋白的基因与GST的基因整合后重组质粒转化到BL21(DE3)菌株并表达，产物为配体蛋白-GST复合物，将经过纯化后的融合蛋白固定在谷胱甘肽亲和树脂上，配体蛋白充当“诱饵蛋白”，GST作为标签，将含有受体蛋白的样品溶液过柱后形成GST-配体蛋白-受体蛋白复合物；再经过洗脱得到的复合物通过二维电泳、肽质谱指纹分析鉴定受体蛋白[15]。GST pull-down是能有效地验证酵母双杂交系统的体外实验，此法灵敏度较高，并且简单易行，操作方便；但融合蛋白中的GST可能会影响配体蛋白的空间结构[14]。

4TAP

TAP是德国学者于1999年开发出的一套研究蛋白质相互作用的技术，它是利用TAP标签，经过两步连续的亲和纯化得到更接近自然状态的特定蛋白复合物，能在真实的生理条件下研究蛋白质相互作用的技术；TAP标签是由葡萄球菌A蛋白的2个免疫球蛋白(immune globulin，Ig)G结合结构域(protein A，ProtA)及1个钙调蛋白结合多肽(calmodulin bond peptide,CBP)组成，ProtA与CBP之间由1个烟草蚀纹病毒(tobacco etch virus,TEV)蛋白酶切割位点隔开[16]。TAP能在真实的生理条件下研究蛋白质的相互作用，一定程度上打破了蛋白质组学研究的瓶颈，运用此项技术寻找新的受体蛋白成为一种重要途径[17]。将配体蛋白的编码基因与TAP标签基因融合于合适的表达质粒，并将构建好的质粒导入相应的细胞并正常表达，表达的融合蛋白将形成稳定的配体蛋白-TAP标签复合物；温和裂解细胞，将裂解液在非变性的条件下与带有标签的配体孵育，再将混合液经过IgG琼脂糖珠亲和柱，与配体结合的受体蛋白可以通过ProtA标签与亲和柱上的IgG琼脂糖珠特异性结合，从混合液中分离出来，再用TEV蛋白酶切割标签，释放仍带有CBP标签的配体蛋白-CBP复合物，并可将其进一步纯化；在钙离子存在的情况下，将纯化后的产物与钙调蛋白包被的亲和珠一起孵育，复合物通过CBP标签又一次结合于钙调蛋白的珠子上，洗剂弃杂后，与含有受体蛋白的样品液孵育，再次洗剂，然后通过乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸洗脱即可得到高纯度的天然构象配体受体蛋白复合物[16]。最后可用二维电泳或质谱分析鉴定受体蛋白。TAP技术的优点有：①实验周期短；②是一种高效的在生理条件下研究蛋白质相互作用的技术，更加真实地反映了细胞内部的组分；③通过两次亲和纯化，提高了目的蛋白的特异性。TAP技术存在的不足有：①TAP标签的引入可能会影响与靶蛋白的结合；②在用TEV酶处理的过程中，少数靶蛋白可能会被破坏；③细胞内源的钙调蛋白与CBP结合可能会影响第二次纯化[16]。

5分子模拟对接

随着人们对生物分子相互作用的认识不断加深以及计算机科学的迅速发展，分子模拟对接技术得以实现。1995年，Accelrys公司开发的计算化学软件Affinity第一个上市[18]；此后，各种分子对接软件不断涌现，相关的各种技术不断完善。分子对接是基于分子之间空间匹配和能量匹配建立人工模拟分子间的识别和结合的[19]。空间识别和能量识别是分子对接的两大课题；几何空间匹配是分子间发生相互作用基础，而能量匹配是分子间保持稳定结合的基础。从基于空间匹配的刚性模型逐渐发展成为基于空间匹配和能量匹配的柔性模型可以将分子对接分为刚性对接、半柔性对接和柔性对接3类[18]。如何才能找到最佳结合位置是对接的关键，这就要计算分子间力学和空间结构，使之尽可能的最优化。因为底物分子和受体分子都是可以自由转动的，同时分子在相互靠近的过程中也在发生自身构象的变化，因此其可能的结合方式非常复杂[20-21]。目前一些主要的分子对接软件有Hyperchem、molecular operating environment (MOE)、Accelrys InsightII和Discovery Studio[18]。分子对接可以提供理论的可能受体分子模型，但该理论分子模型是否为要找的受体蛋白分子还高度依赖进一步的实验验证。如何实现最优化的柔性对接是必须要考虑的问题，如果理论分子模型较多，还需一个一个排查；受限于蛋白质组学的瓶颈，也可能最终得不到结果。

6酵母双杂交系统

酵母双杂交系统是20世纪80年代末发展的一种检测蛋白质与蛋白质相互作用的遗传方法，是利用转录激活因子GAL4(酵母转录激活蛋白Gal4的基因)的特性而建立的;GAL4由2个结构域组成，一个是N端的DNA结合域(DBD)，一个是C端的转录激活域(AD)，两者可以从核酸一级结构上分开并独立表达出有功能的结构域；而当两者在物理空间上靠近时可重新获得完整的转录因子活性[22]。GAL4经过外源重组后的融合基因与自然表达转录激活因子GAL4一样，可结合其顺式元件UASG，并激活信号途径下游半乳糖苷酶基因的转录[16]。当用配体蛋白X的核酸序列同DBD的核酸序列融合可以表达DBD-X，用受体蛋白Y的核酸序列同AD的核酸序列融合可以表达AD-Y；如果X和Y相互作用，则使DBD和AD两结构域在物理空间上靠近，而重显完整的转录激活因子功能，激活其下游基因表达;因此，检测GAL4调控的半乳糖苷酶的活性就可判断X、Y是否相互作用[23]。酵母双杂交技术用于研究细胞核内蛋白质与蛋白质的相互作用，不需提纯蛋白便可研究蛋白的相互作用，消除了提纯过程引起的蛋白变性，因而研究的是有生物活性的蛋白与蛋白之间的相互作用，反映了体内的真实作用情况；再者，因为哺乳动物源性蛋白不易和酵母的内源性蛋白结合，所以这在很大程度上避免了因酵母内源蛋白与插入的外源蛋白结合而引起的干扰；另外，由于基因表达产物的可检测性及表达调控的复杂性，因而蛋白质之间微弱的或暂时的相互作用也可以通过检测表达产物而得到验证[24]。酵母双杂交技术也存在一些固有的局限性：①完整的蛋白质生物学活性还有赖于翻译后的加工修饰(如糖基化、二硫键的形成、甲基化等)，而蛋白质的这些翻译后加工修饰是在位于细胞质中的一些细胞器的参与下完成的；而在双杂交系统分析中，蛋白间的相互作用定位于细胞核内，这些蛋白质还是未经过加工修饰的，可能还不具备某些生物学功能和活性，并且有些蛋白的正确折叠和完整功能的形成有赖于同源或同种系的细胞器的加工修饰而非酵母细胞，也限制了细胞外蛋白和膜受体蛋白等的研究；②由于基因表达调控的模式并非一成不变的，过程非常复杂；某些蛋白本身就具有激活转录功能，不一定由两种外源蛋白的结合而触发转录激活作用；另外，有的蛋白表面的一些基团可以与多种蛋白质产生低亲和力(如某些极性基团、氢键、范德华力等等的作用)，可能启动基因的转录导致产物的表达，这些都能产生“假阳性”结果；③不太适用于寻找某种配体的未知受体蛋白，更适合于验证某种受体蛋白是否能与相应的某种配体结合[24]。

7小结

人类对生命活动的研究早已进入分子领域，新的受体的出现可能会对某些生命活动过程的认识有重要意义，如在一些重大疾病的预防或者诊治以及基础研究领域的应用中有重要价值，而且还可能会对不断发展的蛋白质组学作出贡献。以上的各种研究方法都有其各自的优劣点，研究者可以根据自己的课题特点选择合适的研究方法。随着研究技术和条件的不断发展和完善，相信将来一定会有更趋完美的方法来揭开生命更多的奥秘。

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Progress of Ways to Find Receptor Molecules

ZHANGYong1,ZHANGJun2,NUOZhen-long3,JIANGYi-nan1,YANGChao1,DUXiao-xiao1,CHENZhong-hua1,ZHOUHong-min3. (1.InstituteofOrganTransplantation,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,KeyLaboratoryofOrganTransplantation,MinistryofEducationandMinistryofHealth,Wuhan430030，China; 2.DepartmentofGeneralSurgery,YilingHospital,Yichang443100,China; 3.DepartmentofCardiothoracicSurgery,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030，China)

Abstract：Recognization and interaction between receptor and ligand is an important way for molecules to perform their functions,and has great biological significance.Researches on receptor and ligand have an essential role in biological science.The progress of numerous researches,however,are frequently prevented by the undiscovered receptors of some specified molecular.The methods to find receptor of a molecular include co-immunoprecipitation，phage display,yeast two-hybrid system,molecular docking simulation,glutathione S-transferase pull-down,and tandem affinity purification.Here is to introduce the fundamental theory,procedure,merits and demerits of these methods,in order to provide reference for the related research.

Key words:Co-immunoprecipitation； Phage display； Yeast two-hybrid system； Molecular docking simulation； Tandem affinity purification

收稿日期：2014-08-14修回日期：2014-11-03编辑：郑雪

基金项目：国家自然科学基金(31270955)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.10.007

中图分类号：R33

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)10-1745-04