海拔高度对冠心病患者EPCs数量及功能的研究

买超平，阎春生，哈小琴

· 论著 ·

海拔高度对冠心病患者EPCs数量及功能的研究

买超平，阎春生，哈小琴

目的探讨不同海拔因素下，兰州市（海拔：1520 m）与咸阳市（海拔：386 m）冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）患者外周血内皮祖细胞（EPCs）数量变化。方法2014年4月至12月分别在兰州军区总医院心内科/体检中心和咸阳市中心医院心内科/体检中心共纳入96例。各选取冠心病患者24例为冠心病组，男性12例，女性12例，平均年龄（60.6±10.9）岁；健康体检者24例为对照组，男性12例，女性12例，平均年龄（58.3±8.9）岁。使用流式细胞仪测定入选者外周血EPCs数量。通过ELISA法测定其外周血血清中白介素8（IL-8）、血管内皮生长因子（VEGF）、高同型半胱氨酸（HCY）、低氧诱导因子1α（HIF-1α）、基质细胞衍生因子1a（SDF-1a）。荧光定量PCR检测外周血单核细胞因子CXCR2 mRNA、CXCE4 mRNA、CXCR7 mRNA表达情况。结果兰州市冠心病组EPCs数量与hs-CRP浓度之间进行Spearman相关分析，呈负相关（r=-0.631，P＜0.05）。与对照组比较，兰州市冠心病组HCY降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。在咸阳市，与对照组比较，冠心病组IL-8、HCY降低，VEGF升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）。与兰州市冠心病组比较，咸阳市IL-8降低，VEGF升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）。在女性入选者中，兰州市冠心病组较对照组HCY降低；与对照组比较，咸阳市冠心病组IL-8升高，HIF-1α下降，差异有统计学意义（P均＜0.05）。与兰州市冠心病组比较，咸阳市IL-8升高，HIF-1α降低，差异有统计学意义（P均＜0.05）。与兰州市比较，咸阳市入选者CXCR2表达上调，为（0.91± 0.13） vs. （4.8±1.87），有统计学差异（P＜0.05）。结论冠心病患者较健康人EPCs数量有所降低，低海拔地区健康人较高海拔地区数量增加。IL-8、VEGF、HCY、HIF-1a、SDF-1a、CXCR2因子对研究不同海拔及性别因素下EPCs功能情况有意义，前景广阔。

海拔；冠心病；内皮祖细胞

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）的病理机制十分复杂，与家族遗传、环境等因素有关。内皮细胞的损伤能够加重动脉粥样硬化并且与冠心病的发生发展关系密切。血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）为内皮细胞的前体细胞，在组织缺血及血管损伤时动员入血，参与微血管的生成及血管内皮的修复。Schmidt-Lucke等[1]研究发现，EPCs数量的减少是动脉粥样硬化患者疾病发展的预测因子之一；Eizawa等[2]比较分析了循环EPCs的数量，稳定型心绞痛患者EPCs数目降低而不稳定型心绞痛患者循环EPCs却升高。大多数研究数据表明，EPCs数量越多，心血管疾病风险及死亡率就越低[3-5]。许多生长因子、细胞因子、趋化因子及内皮细胞的凋亡体都可影响EPCs的动员、归巢、增殖、分化、迁移和凋亡[6]。而不同海拔高度情况下冠心病患者内皮祖细胞数量和功能的变化情况，国内外研究较少。本研究检测了不同海拔高度下冠心病患者EPCs数量及功能情况。

1 资料与方法

1.1 研究和对象2014年4月至12月分别在兰州军区总医院心内科/体检中心和咸阳市中心医院心内科/体检中心共纳入96例。各选取冠心病患者24例为冠心病组，男性12例，女性12例，平均年龄（60.6±10.9）岁；健康体检者24例为对照组，男性12例，女性12例，平均年龄（58.3±8.9）岁。纳入标准：均为长住居民（＞10年）；冠心病患者行冠状动脉造影或心脏CTA检查明确诊断为冠心病，标准参考2009年经皮冠状动脉介入治疗指南[7]，每个冠状动脉病变至少采集2个相互垂直的投视角图像，直径狭窄≥50%病变则认为有临床意义。排除合并瓣膜性心脏病、心肌病、糖尿病、急慢性感染、外伤、溃疡、视网膜病、肿瘤、近期外科手术、近3个月发生急性心肌梗死、急性心功能不全等。

1.2 方法

1.2.1 EPCs数量的测定采用流式细胞术检测外周血CD45、CD34+、KDR+、EPCs的比例。经前臂静脉抽取外周静脉血5 ml肝素抗凝，取200μl加入EP管中，再分别加入5μl FITC标记的CD45抗体，PE标记的KDR抗体，APC标记的CD34抗体。每个样本设立阴性对照，只加CD45抗体。混匀后室温避光孵育30 min后每管中再加入6 ml红细胞裂解液避光反应15 min，充分溶解红细胞离心后弃上清液再加入500 μl磷酸缓冲液，最后上流式细胞仪测定。

1.2.2 生化指标检测空腹抽取外周静脉血，肝素抗凝，检测总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇。利用OLYMPUS-5421全自动生化分析仪，采用免疫散色比浊法测定血清中C反应蛋白（CRP）含量。

1.2.3 细胞因子和同型半胱氨酸检测入选病例均抽取空腹静脉血5 mL，3000 rpm离心5 min后吸取血清，置于-70℃保存。成批检测，使用酶联免疫吸附法（ELISA法），试剂盒购自Sigma公司，检测各样本血清中白介素8（IL-8）、血管内皮生长因子（VEGF）、缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、基质细胞衍生因子1a（SDF-1a）、同型半胱氨酸（HCY），操作严格按照试剂盒说明书进行，酶标仪450 nm测得吸光度值，通过标准曲线，计算各样本血清中细胞因子的浓度。

1.2.4 检测单核细胞趋化因子受体2（CXCR2）、趋化因子受体4（CXCR4）、趋化因子受体7（CXCR7） mRNA相对表达量 在Gene Bank数据库中将CXCR2、CXCR4（NM-022205.3）、C X C R 7（N M-0 5 3 3 5 2.1）、G A P D H（M-017008.3）的核苷酸序列查找出来，根据引物设计原则，软件Primer 5.0设计引物。序列如下：CXCR2上游引物：5’-TCGCCGTCGTGCTC ATCTTCC-3’，下游引物：5’-GGCGCTCACAC GTCTCCTGGA-3’。

CXCR4上游引物：5’-GGGTTGGTAAT CCTGGTC-3’， 下游引物：5’-ATGATG TGCTGGAACTGG-3’； CXCR7上游引物：5’-AACCTGGGAACTACTCGG -3’，下游引物：5’-CAAGACGCAGACAACACG-3’。样本抗凝处理后立刻按照密度梯度离心法提取单核细胞，Trizol试剂提取细胞总RNA，氯仿抽提，异丙醇乙醇沉淀洗涤后，用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水溶解RNA测定RNA OD值，紫外分光光度计算出浓度[1000/OD值（260 nm～280 nm）]，根据TAKALA逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，-20℃保存，以cDNA为模板按照反应条件：95℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30个循环。最后72 ℃ 10 min，降温到4 ℃。进行实时荧光定量PCR扩增反应。实验设置副孔，取平均CT值，根据公式：ΔΔCT＝（CT目的基因－CT内参）冠心病组－（CT目的基因－CT内参）健康组；算出倍数＝2－ΔΔCT。

1.3 统计学分析数据处理采用SPSS 18.0统计学软件。计数资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 兰州、咸阳市入选者外周血内皮祖细胞数量比较与对照组比较，兰州市与咸阳市冠心病组EPCs数量略有增加，但对比无统计学意义（P均＞0.05）。兰州市对照组和冠心病组与咸阳市比较，差异无统计学意义（P均＞0.05）（表1）。

2.2 兰州市冠心病组EPCs数量与hs-CRP水平相关性分析兰州市冠心病组EPCs数量与高敏C反应蛋白（hs-CRP）浓度之间进行Spearman相关分析，呈负相关（r=-0.631，P＜0.05）。

2.3 男性入选者IL-8、VEGF、HCY、SDF-1a、HIF-1α检测结果与对照组比较，兰州市冠心病组HCY降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。在咸阳市，与对照组比较，冠心病组IL-8、HCY降低，VEGF升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）。与兰州市冠心病组比较，咸阳市IL-8降低，VEGF升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）（表2）。

2.4 女性入选者IL-8、VEGF、HCY、SDF-1a、HIF-1α检测结果在女性入选者中，兰州市冠心病组较对照组HCY降低；与对照组比较，咸阳市冠心病组IL-8升高，HIF-1α下降，差异有统计学意义（P均＜0.05）。与兰州市冠心病组比较，咸阳市IL-8升高，HIF-1α降低，差异有统计学意义（P均＜0.05）（表3）。

2.4 单核细胞中CXCR2、CXCR4和CXCR7的mRNA表达检测与兰州市比较，咸阳市入选者CXCR2表达上调，为（0.91±0.13） vs. （4.8± 1.87），有统计学差异（P＜0.05）（表4）。

3 讨论

EPCs数量下降及功能减退与冠心病发病有关。有研究表明，EPC数量减少是动脉粥样硬化的独立危险因素。其在内皮修复过程中起着重要作用。Zhang Q等[8]认为EPCs的数量水平可预测心血管不良事件。CD34/KDR双阳性是检测内皮祖细胞数量的主要方法[9]。方叶青等[10]发现冠心病患者外周血EPCs数量较正常人明显减少，而且形成细胞集落数、细胞的增殖能力也明显降低。

CRP是一种急性期反应蛋白，可以反应炎症水平，能激活补体、促进吞噬并具有其他的免疫调控作用[11]。陈良友等[12]研究表明，冠心病患者CRP和血浆HCY均高于对照组。IL-8具有趋化作用，可使大量T细胞和巨噬细胞出现在斑块破裂的部位，对粥样斑块的形成和破裂有重要作用。唐任光等[13]发现冠心病患者血清IL-8水平高于正常对照组。王进等[14]认为EPCs数量与VEGF浓度呈正相关。同时Strakova J 等[15]认为血浆HCY水平升高也是冠心病独立危险因素。HIF-1 α是调节细胞内氧代谢的关键因子之一，由组织中分子氧水平的改变所诱导，能激活许多缺氧反应性基因的表达，使机体产生一系列低氧适应反应[16-18]。

EPCs介导的血管生成过程受许多生化因子的调控，一些研究认为CXCR7能够促进EPCs的增殖、粘附、趋化和激活下游信号分子[19]。Hristov M等[20]发现CXCR2及其配体CXC趋化因子也参与了EPCs的动员、增殖、迁移，促进了EPCs的黏附功能。

表1 外周血内皮祖细胞（CD34、KDR双阳性率）数量比较

表2 兰州市及咸阳市男性冠心病组与对照组比较（ng/L）

表3 兰州市及咸阳市女性冠心病组与对照组比较（ng/L）

冠心病的病理机制十分复杂，且与危险因素、家族遗传、环境等方面均有关，而国内外学者对冠心病的具体机制尚未达成共识。本研究通过测量细胞因子的水平以及表达，分析可能的致病机制。同时，本研究还存在一些局限性，比如由于患者的配合程度和经费条件所限，两地样本的提取数量太少。另外，关于海拔因素下冠心病患者EPCs的功能变化文献较少，选择测定因子的实验研究处于探索阶段。

表4 单核细胞中CXCR2、CXCR4和CXCR7的mRNA表达

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Quantity and function of endothelial progenitor cells in patients with coronary heart disease influenced by different altitude factors

MAI Chao-ping*, YAN Chun-sheng, HA Xiao-qin.*College of Public Health, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China.

YAN Chun-sheng, E-mail: yanchsh@lzu.edu.cn

ObjectiveTo discuss the quantity changes of endothelial progenitor cells (EPCs) in patients with coronary heart disease (CHD) influenced by different altitude factors (altitude=1520 m in Lanzhou City and altitude=386 m in Xianyang City).MethodsThe cases (n=96) were chosen from Lanzhou City and Xianyang City from Apr. 2014 to Dec. 2014, and then 24 CHD patients (male 12, female 12 and average age=60.6±10.9) were chosen respectively from Lanzhou City and Xianyang City as Lanzhou CHD group and Xianyang CHD group, and 24 healthy controls (male 12, female 12 and average age=58.3±8.9) were chosen respectively from Lanzhou City and Xianyang City as Lanzhou control group and Xianyang control group. The quantity of EPCs of peripheral blood (PB) was detected by using flow cytometer. The changes of PB serum interleukin-8 (IL-8), vascular endothelial growth factor (VEGF), homocysteine (Hcy), hypoxia inducible factor-1a (HIF-1α) and stromal cell derived factor 1a (SDF-1a) were detected by using ELISA. The expressions of PB mononuclear monocytes-CXCR2 mRNA, CXCE4 mRNA, CXCR7 mRNA were detected by using RT-PCR.ResultsIn Lanzhou CHD group, Spearman correlation analysis showed that EPCs quantity was negatively related to hs-CRP concentration (r=-0.631, P＜0.05). Compared with Lanzhou control group, Hcy decreased in Lanzhou CHD group (P＜0.05). Compared with Xianyang control group, IL-8 and Hcy decreased and VEGF increased in Xianyang CHD group (all P＜0.05). Compared with Lanzhou CHD group, IL-8 decreased and VEGF increased in Xianyang CHD group (all P＜0.05). Among woman objects, Hcy decreased in Lanzhou CHD group compared with Lanzhou control group. Compared with Xianyang control group, IL-8 increased and HIF-1α decreased in Xianyang CHD group (all P＜0.05). Compared with Lanzhou CHD group, IL-8 increased and HIF-1α decreased in Xianyang CHD group (all P＜0.05). The expression of CXCR2 was up-regulated in Lanzhou group compared with Xianyang group [(0.91±0.13) vs. (4.8±1.87), P＜0.05].

R541.4

A

1674-4055(2015)06-0754-04

2015-06-26）

（责任编辑：姚雪莉）

国家自然科学基金资助课题(81060015);甘肃省自然基金项目(110TRJ2A114)

730000 兰州,兰州大学公共卫生学院营养与食品卫生研究所(买超平,阎春生);兰州军区总医院检验科(哈小琴)

阎春生,E-mail:yanchsh@lzu.edu.cn;哈小琴,E-mail:18294437996@163.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2015.06.09