控制性肺膨胀对兔外源性肺损伤的疗效及其机制探讨

汪洋，刘晓伟，徐志鸿，张艳飞

（中国医科大学附属第一医院急诊科，沈阳 110001）

·论著·

控制性肺膨胀对兔外源性肺损伤的疗效及其机制探讨

汪洋，刘晓伟，徐志鸿，张艳飞

（中国医科大学附属第一医院急诊科，沈阳 110001）

目的探讨控制性肺膨胀对外源性急性肺损伤动物模型肺保护作用及其机制。方法应用静脉注射油酸成功复制外源性急性肺损伤模型，免疫组织化学方法检测肺组织IL-10和IL-6蛋白表达；用ELISA双抗夹心法检测血清中IL-10和IL-6含量；Western blot检测肺组织和肺泡灌洗液中SP-A蛋白表达；逆转录PCR测定肺组织中ICAM-1mRNA和SP-A mRNA表达；流式细胞仪定量分析肺组织细胞凋亡。结果35 cmH2O压力维持20 s的肺复张方法能有效提高PaO2和PaO2/FiO2，降低PaCO2，改善氧合和肺顺应性，对肺外源性急性肺损伤的复张效果良好；与对照组比较，控制性肺膨胀治疗组肺组织和血清IL-10及IL-6含量明显增高（P＜0.05），肺组织和肺泡灌洗液SP-A表达水平显著减少（P＜0.05）；流式细胞仪检测结果显示，实验组细胞凋亡率明显高于对照组（P＜0.05）。结论控制性肺膨胀可通过抑制凋亡，减轻急性肺损伤时的炎性反应，降低肺水肿程度，减少肺组织SP-A降解，促进肺泡SP-A合成与分泌，对外源性急性肺损伤的保护作用较好。

急性肺损伤；控制性肺膨胀；白介素6；白介素10；肺表面活性物；凋亡

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的基础病变，是多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）在肺脏的表现［1］，其本质是由各种原因直接或间接损伤肺毛细血管内皮细胞，导致内皮细胞功能障碍，肺毛细血管通透性增高的血管渗漏综合征。ALI具有较高的致死率，属于临床重症治疗中的难点［2］。早期诊断、早期合理干预是降低ALI患者病死率的关键，机械通气是重要的支持和治疗手段，应用合理的机械通气策略，可为肺损伤的缓解和恢复创造条件。

控制性肺膨胀（sustained inflation，SI）是一种肺复张方法，机械通气时通过给予足够的气道压力，使塌陷的肺泡充分复张，且屏气一段时间，增加肺泡的稳定性，从而达到增加机体氧合的目的［3，4］。本研究应用控制性肺膨胀这一肺复张方法干预治疗外源性ALI动物模型，采用免疫组织化学、流式细胞技术、免疫印记技术、基因逆转录扩增技术（RTPCR）等分别从动物临床症状、肺组织形态、肺组织炎性细胞因子、细胞间黏附分子、肺表面活性物质的蛋白表达以及细胞凋亡等方面对SI肺保护作用及其机制进行多层次、多角度的对比研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选用24只健康新西兰兔，建立外源性ALI动物模型后将实验动物随机分为3组，每组8只。空白对照组（C组）：不做任何处理，仅观察指标；ALI组（EP0组）：静脉内注射油酸造成ALI；治疗组（EP1组）：静脉内注射油酸造成ALI后，采取SI（35 cmH2O、20 s）进行肺复张。

1.2 主要试剂及设备

组织总蛋白提取试剂盒购自天根生化科技公司，Western blot抗体购自英国ABCam，SP9001试剂盒及DAB显色剂购自美国Santa Cruz公司，凋亡试剂盒购自武汉华美生物工程公司，RNA提取Trizol试剂购自美国Gibco BRL公司，RNA酶抑制剂和逆转录试剂盒购自美国Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 实验动物临床观测指标：记录每组实验动物造模前、后和基础通气30、60 min的下述指标：（1）气体交换指标：动脉血氧分压（PaO2）、动脉血二氧化碳分压（PaCO2）、血pH；（2）呼吸力学指标：吸气峰压（peak inspiratory pressure，PIP）、气道平台压力（plateau pressure，Pplat）、计算呼吸系统动态顺应性（dynamic compliance，Cdyn）；（3）血流动力学指标：平均动脉压力（mean artery pressure，MAP）、心率（heart rate，HR）。

1.3.2 蛋白印记：取蛋白样本，经变性、电泳、转膜、一抗（1∶100稀释）4℃孵育过夜、洗膜后二抗室温孵育30 min，ECL发光，显影。结果处理，以目的条带与内参照β-actin的光密度比值作为目的基因相对表达量。

1.3.3 免疫组织化学方法检测IL-10和IL-6蛋白表达：采用SP法，样本10%甲醛溶液固定，常规制作组织蜡块，石蜡切片，0.3%甲醇-过氧化氢室温下孵育20 min，抗原修复，一抗（羊抗兔IL-10、IL-6 IgG多克隆抗体，1∶100），PBS清洗3次，每次5 min，分别滴加二抗（生物素标记羊抗兔IgG）工作液，37℃温箱湿盒内孵育30 min；PBS清洗3次，每次5 min，滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液，DAB显色2～5 min，自来水充分冲洗，终止显色，梯度乙醇脱水，中性树胶封固。阴性对照用PBS替代一抗，其余步骤同上，光镜观察阳性细胞表达部位并照相。结果判定：（1）着色细胞占细胞计数百分率＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；（2）无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分；棕褐色为3分；（3）二者相乘即阳性等级。0分为阴性，1～4分为弱阳性，5～8分为阳性，9～12分为强阳性。

1.3.4 逆转录PCR测定肺组织目的基因表达：总RNA提取，取肺组织0.1 g，剪碎后加人1 mL Trizol Reagent，用无菌注射器反复抽吸使之成乳状，再用氯仿、异丙醇、酒精等处理后提取总RNA。在紫外分光光度下检测波长在260、280 nm的吸光度值，计算提取物RNA浓度，判定其纯度；反转录合成cDNA，在20 μL反转录反应体系中加入样本RNA、2倍缓冲液、25 mmol/L硫酸镁、寡核苷酸、RNA酶抑制剂、寡核苷酸引物和逆转录酶，混匀后65℃l min、30℃5 min、30 min匀速升温至65℃30 min、98℃5 min、5℃5 min，其产物即cDNA；常规PCR扩增。

1.3.5 流式细胞仪分析细胞凋亡：单细胞悬液制备，Annexin Ⅴ-FITC+PI双染，1 h内用流式细胞仪检测，激发波长488 nm，双参数分析绿荧光（Annexin Ⅴ标记的胞膜完整但外翻的细胞）及红荧光（PI标记的胞膜破损细胞）MODFIT软件分析细胞凋亡结果，结果以散点图形式输出。左上代表细胞碎片；右上代表坏死或凋亡晚期细胞；左下代表正常细胞；右下代表早期凋亡细胞。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 血气分析、血流动力学指标

EP1组在各时间点（30、60 min）PaO2/FiO2和PaO2均明显高于EP0组（P＜0.05），EP1组较EP0组改善更显著；EP1组在机械通气后60 min时PaCO2变化与EP0组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

机械通气30、60 min时，EP1组HR变化与EP0组比较差异有统计学意义（P＜0.05），而MAP变化组间差异无统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1 肺外源性ALI家兔血气分析指标Tab.1 The blood gas analysis of rabbit with lung exogenous ALI

表2 肺外源性ALI家兔血流动力学指标变化Tab.2 Changes in hemodynamic indexes of rabbit with lung exogenous ALI

2.2 肺组织中IL-10、IL-6的变化

IL-10、IL-6阳性染色为棕黄色。C组、EP0组和EP1组肺组织中IL-10和IL-6均呈弱阳性表达，在肺泡上皮细胞、血管内皮细胞内可见微量棕黄色阳性颗粒（图1、2）。

2.3 各组血清中IL-10、IL-6含量变化

与C组比较，EP0、EP1组血清中IL-10、IL-6含量均显著增加（P＜0.05），而EP1组血清中IL-10含量低于EP0组（P＜0.05）。见表3。

图2 各组肺组织中IL-6表达情况 免疫组化×200Fig.2 The expression of IL-6 in lung tissue of each group IHC×200

2.4 肺组织和肺泡灌洗液中SP-A蛋白和mRNA表达

与C组比较，EP0、EP1组肺组织和肺泡灌洗液中SP-A蛋白含量和mRNA表达均显著减少；EP1组肺组织和肺泡灌洗液中SP-A蛋白含量和mRNA表达均明显高于EP0组，见图3。

表3 血清中IL-10、IL-6含量比较（pg/mL）Tab.3 Comparison of IL-10 and IL-6 content in serum（pg/mL）

图3 肺组织和肺泡灌洗液SP-A蛋白及mRNA表达Fig.3 The expression of SP-A protein and mRNA in lung tissue and bronchoalveolar lavage fluid

2.5 肺组织细胞凋亡结果

经流式细胞仪检测，C组、EP0组、EP1组肺组织细胞凋亡率分别为（14.56±1.67）%、（23.61± 2.58）%、（19.16±2.14）%。与C组比较，EP0、EP1组肺组织细胞凋亡率均明显升高（P＜0.05），EP0与EP1组间差异亦有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

急性肺损伤是一种临床急危重症，肺容积明显减少且病变不均一是ALI的重要特征。国内外的研究资料显示［5，6］，ALI主要以肺泡及肺间质水肿，大量肺泡萎陷且程度不均一为特点。ALI目前尚无简单而可靠的诊断指标，仍根据临床表现进行综合判断。ALI的发病机制尚未完全阐明，随着科学及各项技术的发展，人类对于ALI的发病机制有了更深刻的认识，主要包括以下方面［7］：（1）炎性细胞因子的失衡；（2）细胞间黏附分子的参与；（3）肺表面活性物质（pulmonary surfactant，PS）系统的异常；（4）细胞凋亡等。

SI是近年来研究较多的机械通气新策略，无论是动物实验还是临床研究均显示对ALI/ARDS有良好的疗效［8］。研究显示，SI复张后肺容积明显增加，提示SI能够促进塌陷肺泡的复张［9］。还有研究结果显示，SI的应用能够显著提高氧合，增加肺顺应性、呼气末肺容积以及功能残气量，减少机械通气时的死腔量，减轻肺水肿与肺损伤程度，达到治疗ALI的目的［10］。SI等肺泡复张手法能显著改善氧合的原因在于：通过给予气道较高的压力，使较多的萎陷肺泡复张，改善肺内气体分布，从而减少分流，改善了通气/血流比例，使肺部氧合增加；SI持续一定的时间有助于时间常数不同的肺泡的气体均匀分布，并且延长气体交换时间，也增加肺部的氧合［11，12］。

本研究建立ALI动物模型，通过预实验，选择最适SI压力（35 cmH2O 20 s）治疗外源性ALI，实验结果显示，SI治疗能有效改善动物血气分析及血流动力学指标，为进一步阐明其治疗机制，本研究从分子生物学水平及细胞水平揭示SI对炎性因子IL-10及IL-6、肺表面活性物SP-A以及细胞凋亡的影响。研究结果发现，ALI中存在着促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的平衡失调，而SI不仅可以抑制促炎细胞因子的含量，同时抑制抗炎细胞因子的分泌，有利于维持机体炎性反应的平衡，且对外源性ALI的作用更加明显。ALI存在SP-A下调的现象，SI治疗后动物肺组织及肺泡灌洗液中SP-A含量升高，表明实施SI对改善ALI引起的SP-A含量下降作用明显。其原因为：SI治疗可减轻肺组织炎性反应，降低肺水肿发生程度，使肺泡SP-A合成增加、降解减少，肺泡灌洗液及肺组织SP-A蛋白表达均增加。流式细胞仪分析结果发现SI可通过抑制ALI时异常增高的肺组织细胞凋亡，使肺组织炎性反应降低，肺脏损伤程度减弱。

综上所述，SI可通过抑制凋亡，减轻ALI时的炎性反应，降低肺水肿程度，减轻AT-Ⅱ的损伤，减少肺组织SP-A降解，促进肺泡SP-A合成与分泌，维持AT-Ⅱ正常的结构与功能，从而发挥对外源性ALI保护作用。

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（编辑武玉欣）

Study of Sustained Inflation and Its Mechanism for Exogenous Acute Lung Injury Animal Models on
Lung Protection

WANG Yang，LIU Xiao-wei，XU Zhi-hong，ZHANGYan-fei

（Department of Emergency，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo evaluate the lung protective effect of sustained inflation（SI）and its mechanism for exogenous acute lung injury（ALI）animalmodels.MethodsExogenousacute lung injury animalmodelswere replicated using intravenous injection ofoleic acid.Immunohistochemistry and double antibody sandwich ELISA were carried out to detect IL-10 and IL-6 protein levels in lung tissues and serum.Western blot was used to detect the expression level of SP-A in lung tissue and bronchoalveolar lavage fluid（BALF）.The expression of ICAM-1and SP-A mRNA in lung tissue was measured by reverse transcription PCR.The apoptosis of lung tissue cells was detected by flow cytometry.ResultsThe maintenance of 20 s lung recruitment method of 35 cmH2O pressure could improve PaO2and PaO2/FiO2，reduce PaCO2，and improve oxygenation and pulmonary compliance.The re-expansion effect of sustained inflation for exogenous acute lung injury was good.The IL-10 and IL-6 levels in lung tissue and serum for SI group were significantly higher than those of the control group（P＜0.05）.The SP-A expression level of lung tissue and BALF in SI group was significantly reduced compared with the control group（P＜0.05）.Flow cytometry analysis showed that the apoptosis rate of SI group was significantly higher than that of the control group（P＜0.05）.ConclusionSustained inflation played an important role in lung protection against exogenous ALI through inhibition of apoptosis，lightening of inflammatory response，reduction of pulmonary edema and SP-A degradation in lung tissue，as well as promotion of SP-A synthesis and secretion in pulmonary alveolus.

acute lung injury；sustained inflation；IL-10；IL-6；pulmonary surfactant；apoptosis

R655.3

A

0258-4646（2015）06-0498-05

辽宁省自然科学基金（201202284）

汪洋（1971-），男，副教授，博士. E-mail：wywxt2000@sohu.com

2015-01-14

网络出版时间：