Gordonia sp. LAM0048的分离鉴定及其降解正十六烷的研究

陈小蓉, 阮志勇, 王彦伟, 王慧敏, 郭 翔, 孔德龙, 邵承斌

1.重庆工商大学环境与生物工程学院, 重庆 400060;2.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所, 农业部农业微生物资源收集与保藏重点实验室, 北京 100081;3.农业部农村可再生能源开发利用重点实验室, 成都 610041

随着全球石油使用量的快速增加、长期不科学使用以及运输开采过程中泄漏等问题，一些高毒、高残留、难降解、致癌、致畸等烃类物质进入土壤和地下水，对环境造成污染并严重危害人类健康[1]。烷烃作为石油的主要成分，在石油中的含量高达50%～95%[2]，同时也是石油污染物中的主要成分[3]。如何有效的减少或消除石油烃污染，已成为人们广泛关注的重点问题。目前治理石油污染的方法主要包括物理修复法、化学修复法和生物修复法，其中生物修复法相比于其他两种修复方法，具有高效、无二次污染、易操作和成本低等优点，已成为石油污染修复的重要方法[4]。

如何快速高效降解烷烃是石油污染修复的关键技术，分离烷烃降解微生物并了解降解菌的生理生化特征及分类进化地位是实现生物修复石油污染环境的重要基础。目前，已经分离报道的烷烃降解菌有黄杆菌(Flacobacterium)[5]、戈登氏菌(Gordonia)[6]、假单孢菌(Pseudominas)、海杆菌(Marinobacte)[7]和迪茨氏菌(Dietzia)[8]等。

由于已公开报道的大多烷烃降解菌株可降解的烷烃浓度都较低，在实际应用中易受到限制，因此考虑高烷烃浓度污染下的生物修复。本研究开展了从烃类污染土壤中富集高效烷烃降解菌的工作，以筛选出高烷烃浓度耐受性的菌株为目的，分离筛选到一株高耐受性烷烃降解菌LAM0048，经形态学观察、生理生化试验、细胞化学组分分析和16S rRNA基因序列分析，初步确定其为戈登氏属(Gordonia)的一个种，将其定名为Gordoniasp. LAM0048，并对其烷烃降解能力进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 试剂与培养基

所有试剂除特殊说明外均为市售分析纯或色谱纯。

富集培养基为营养肉汤培养基(nutrient broth，NB，BD/Difco 234000，美国)。添加琼脂15～20 g/L制成斜面或平板(NA)；无机盐培养基：KH2PO40.50 g,Na2HPO4·12H2O 1.00 g,NH4Cl 1.10 g,MgSO4·7H2O 0.20 g, 微量元素液2 mL, 酵母提取物0.03 g,蒸馏水1 L，pH 7.3；微量元素液：EDTA 0.500 0 g,ZnSO4·7H2O 0.220 0 g, CaCl20.050 0 g, MnCl2·4H2O 0.051 0 g, FeSO4·7H2O 0.019 9 g,(NH4)6Mo2O24·4H2O 0.011 0 g, CuSO4·5H2O 0.015 7 g, CoCl2·6H2O 0.016 1 g, 蒸馏水 1 L，pH 6.0；脂肪酸分析培养基为TSA培养基(BD/Difco 236950,美国)。

1.2 烷烃降解菌株的分离

利用富集培养的方法筛选烷烃降解菌，所用土样采自长期受烷烃及多环芳烃污染环境中的下层土壤。

取1.0 g土样加入已灭菌的50 mL富集培养基中，30℃、160 r/min振荡培养。富集培养24 h后，取2 mL富集液接种至50 mL浓度为2 g/L的正十六烷无机盐培养基中，继续振荡培养3 d，重复3次。采用连续梯度稀释法进行分离，取100 μL培养液均匀涂布于含200 mg/L正十六烷的无机盐培养基平板上，30℃恒温倒置培养3 d。根据菌落生长时间、形态及颜色的不同进行分离纯化。挑取单菌落接种于含200 mg/L正十六烷的无机盐液体培养基中，30℃、160 r/min振荡培养，以未接种的培养基作为对照，期间观察菌株生长和正十六烷烃状态变化情况。3 d后获得6株生长迅速、正十六烷烃明显变化的菌株。将分离得到的6株菌株经多次纯化后，15%甘油中-80℃低温保藏。将筛选出的正十六烷烃状态变化最明显的菌株编号为LAM0048，并将其保存至中国农业微生物菌种保藏管理中心(保藏编号为ACCC 19754)。

1.3 菌株LAM0048的鉴定

对菌株LAM0048进行形态学观察、生理生化试验、细胞化学组分分析以及16S rRNA基因序列分析，确定其分类地位；菌株的形态及生理生化特性参考Ruan等[9]的方法进行。

菌株的DNA提取与纯化参照Marmur等[10]的方法进行。以提取的基因组DNA为模板，采用16S rRNA基因的通用引物27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R: 5′-ACGGHTAC-CTTGTTTACGACTT-3′对其进行16S rRNA基因扩增。PCR产物利用PCR产物回收试剂盒 (天根公司) 回收后，酶连接到pMD18-T载体上，转化至E.coliDH5α感受态细胞中，通过蓝白斑筛选，挑选阳性克隆子，由上海英骏公司测序。16S rRNA测序结果在EzTaxon-e Serveice中对比[11]，寻找具有较高同源性的16S rRNA基因序列；比对结果采用MEGA6[12]软件包进行多序列对比分析，采用邻近法(Neighbor-joining)构建基因序列的系统发育树。

将菌株LAM0048接种到TSA培养基上，30℃培养18 h，收集新鲜的菌体后，根据MIDI系统操作手册提取脂肪酸，采用含MIS Library Generation Software的高效气相色谱仪检测其脂肪酸组成[9]。

将菌株LAM0048在NB培养基中30℃培养18 h，离心收集菌体并用生理盐水冲洗2次，按照Xu等[13]的方法进行极性脂的提取与分析。

1.4 菌株LAM0048降解正十六烷烃能力的测定

将菌株在NB培养基中培养至对数生长期(OD600=0.6)，离心菌体并用无菌水冲洗，最后按1%(V/V)的接种量，分别接种至含0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.8%和1.0%(V/V)正十六烷的50 mL无机盐培养基中，30℃，160 r/min培养，设置3组平行，以不加菌的含烷烃培养基为空白对照，36 h后利用气相色谱(GC)检测正十六烷残留量，计算菌株对正十六烷的降解率。

1.5 正十六烷残留量的测定与分析方法

烷烃降解率的测定方法参照陆健等[14]的方法进行，具体操作步骤：在50 mL烷烃培养液中加入15 mL色谱纯正己烷，轻轻振荡以溶解表层烷烃相。将此混合液倒入250 mL分液漏斗中剧烈振荡，静置分层，吸取上清液至50 mL容量瓶中，在残液中加入15 mL正己烷按以上步骤重复萃取2次，合并萃取液并用正己烷定容至50 mL。将此萃取液过0.22 μm滤膜除杂，取1 μL进行GC测定。色谱柱为DN-5MS石英毛细柱(30 m×0.25 mm)，色谱条件：80℃保持5 min，以5 ℃/min升至140℃保持1 min，以5 ℃/min升至280℃。进样口和检测器温度分别为260℃和280℃。

1.6 正十六烷降解率的计算方法

在测定的正十六烷残留量色谱图中，计算残留正十六烷的峰面积与空白对照中正十六烷的峰面积的比值，以百分之百减去峰面积比值，即得降解率。

2 结果与分析

2.1 菌株LAM0048的初步鉴定

菌株LAM0048在NA平板上菌落呈橘红色、不透明、边缘光滑、表面微粗糙。菌体形态如图1(彩图见封三图版)所示，为短杆状，大小为1.0～1.5 μm，革兰氏阳性菌。生长温度为15～48℃，pH范围：5～9，耐受NaCl浓度为7% (W/V)，能利用吐温-40、吐温-80、麦芽三糖、鼠李糖、核糖、蔗糖、丙酮酸甲酯、丙酮酸和甘油。

图1 菌株LAM0048的菌体形态Fig.1 Morphology of strain LAM0048.(彩图见封三图版)

通过PCR扩增，得到长度为1 433 bp的16S rRNA基因序列片段。将测得的16S rRNA序列在NCBI上进行对比，结果显示菌株LAM0048与棒杆菌亚目(Corynebacterineae)、诺卡菌科(Nocardiaceae) 的GordoniaterraeNBRC 10016T、GordonialacunaeDSM 45085T、GordonianamibiensisNBRC 108829T和GordoniabronchialisDSM 43247T的进化关系接近，16S rRNA序列相似性分别为99.03%、98.73%、97.28%和97.21%。图2为菌株LAM0048及相关菌株的16S rRNA序列构建的系统发育树，可以看出，菌株LAM0048与GordonialacunaeDSM 45085T处于同一亚支且与GordoniaterraeNBRC 100016T处于同一大支，稳定性较高。结合16S rRNA序列比对结果以及系统发育树的分析，将其归为戈登氏属(Gordonia)，并命名为Gordoniasp. LAM0048。

菌株LAM0048的主要脂肪酸为C16∶0、C18∶1、TSBA(10-methyl C18∶0)和Summed feature 3(C16∶1ω7c/C16∶1ω6c)，详细脂肪酸含量见表1。同G.terreaNBRC 100016T相比，菌株LAM0048脂肪酸组成和含量的差异性较为明显，主要体现在脂肪酸C16∶1cis9与Summed feature 3上，具体差异见表1。

菌株LAM0048的主要极性脂如图3所示，主要为双磷脂酰甘油(diphosphatidylglycerol，DPG)、磷脂酰乙醇胺 (phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)、两种磷脂酰肌醇甘露糖苷(phosphatidylinositol mannoside，PIM)和四种糖脂(glycolipids，GL)。与菌株GordoniaterraeNBRC 100016T相比，其主要极性脂组成一致，而次要组成上存在较明显差异，具体结果如表2所示。

图2 利用NJ法构建的基于16S rRNA的菌株系统发育树Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences of strain.

脂肪酸LAM0048G.terrea[15]C14∶02.52C16∶1cis9ND17C16∶034.133C18∶124.434C18∶02.51TBSA19.512Summedfeature313.4ND

注：Summed feature 3为C16∶1ω7c/C16∶1ω6c；ND：未检测到。

图3 菌株LAM0048的极性脂Fig.3 Total polar lipids of strain LAM0048.

表2 菌株LAM0048与相似菌株G. terrea的极性脂比较Table 2 Polar lipid comparation of strain LAM0048 and G. terrea NBRC 100016T.

通过菌株LAM0048的形态学特征、生理生化指标以及16S rRNA基因序列的对比结果，表明该菌株属于戈登氏属(Gordonia)，但是该菌株与其系统进化最接近的菌株相比，在底物利用、脂肪酸组成与含量以及极性脂的组成等方面存在较为明显的差异，推测其可能为戈登氏属的一个新种，其确定的分类地位还需要通过DNA-DNA杂交或者基因组学分析进一步明确。

2.3 菌株LAM0048的烷烃降解特性

在30℃，培养36 h时，菌株LAM0048对不同浓度正十六烷(C16)的降解率如图4所示，当C16浓度为0.05%时，其降解率为100%，而随C16浓度的增加，菌株对烷烃的降解率有所降低，但浓度升高至1.0%(V/V)时，降解率仍然能够达到46.4%。实验结果表明，菌株LAM0048对正十六烷(C16)具有良好的降解能力，且能耐受高浓度的烷烃，是一株具有良好应用前景的高效烷烃降解菌。

图4 菌株LAM0048在不同C16浓度下的降解率变化Fig.4 Degradation change of n-hexadecane with different concentrations by strain LAM0048.

3 讨论

本研究以正十六烷为唯一碳源，从土样中分离到一株高效烷烃降解菌LAM0048。经过形态特征观察、生理生化实验、16S rRNA基因序列比对分析，将其划分到戈登氏属(Gordonia)。细胞脂肪酸和极性脂的比对分析结果表明，菌株LAM0048可能为该属的一个新种。

在烷烃利用实验中，菌株LAM0048表现出良好的烷烃降解能力，36 h内能够完全降解0.05%(V/V)的C16，且对烷烃的耐受浓度较高，在含1.0% (V/V) C16的无机盐培养基中，36 h时的降解率仍高达46.4%，对烷烃降解效果明显。

近年来已经公开报道的烃类降解微生物较多，虽然其中大多数菌株的降解效果较为理想，如Wang 等[8]报道的烷烃降解菌株DietziaDQ12-45-1b 在含0.3%(V/V)C16的无机盐培养基中，培养21 d 时，能降解81.17 mg正十六烷。张楠[16]报道的烷烃降解菌Pseudomonasaeruginosa在培养6 d时，对0.26%(V/V)的C16降解率为97.3%。吴佩春等[17]报道的石油降解菌Streptomycesexfoliatus，14 d时对原油[0.03%(V/V)]的降解为83%，但其菌株对正十六烷烃类浓度都有一定要求，一般浓度都在0.39%(V/V)以下。而本研究所分离的烷烃降解菌株LAM0048对正十六烷烃浓度耐受性较高，能够在高浓度[1.0%(V/V)]下高效率降解烷烃。这一发现对石油污染的环境修复具有十分重要的意义，为高浓度污染源的修复提供了理论基础，丰富了石油污染修复的菌种资源。

[1] 黄 艺，礼 晓，蔡佳亮. 石油污染生物修复研究进展[J]. 生态环境学报，2009，18(1):361-367.

[2] Xia W J，Du Z F，Cui Q F，etal.. Biosurfactant produced by novelPseudomonassp. WJ6 with biodegradation of n-alkanes and polycyclic aromatic hydrocarbons [J]. J. Hazard. Mater.，2014, 276：489-498.

[3] 马秋莎，刘 硕，王继富，等. 石油污染湿地中长链烷烃的微生物降解研究进展[J]. 湿地科学，2014，12(2):244-250.

[4] 郭 娜，李志敏，叶 勤. 烷烃降解菌的筛选、鉴定及优势菌株的降解特性[J].应用与环境生物学报，2011，17(4):572-576.

[5] Costa A S, Romão L P C, Araújo B R,etal.. Environmental strategies to remove volatile aromatic fractions (BTEX) from petroleum industry wastewater using biomass[J]. Bioresour. Technol., 2012, 105: 31-39.

[6] 王丽萍,刘昱惠,邵宗泽. 一株来自大西洋表层海水的烷烃降解菌Gordoniasp. S14-10的分离鉴定及其降解相关特性的分析[J]. 微生物学报, 2009, 49(12):1634-1642.

[7] Richard C, Striebich C E S, Thusitha S G,etal.. Characterization of the F-76 diesel and Jet-A aviation fuel hydrocarbon degradation proles ofPseudomonasaeruginosaandMarinobacterhydrocarbonoclasticus[J]. Int. Biodeter. Biodegr., 2014, 93, 33-43.

[8] Wang X B, Chi C Q, Nie Y,etal.. Degradation of petroleum hydrocarbons (C6-C40) and crude oil by a novelDietziastrain [J]. Bioresour. Technol., 2011, 102, 7755-7761.

[9] Ruan Z, Wang Y, Song J,etal..Kurthiahuakuiisp. nov., isolated from biogas slurry, and emended description of the genusKurthia[J]. Int. J. Syst. Evol. Microbiol.，2014, 64, 518-521.

[10] Marmur J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms [J]. J. Mol. Biol., 1961，3：208-218.

[11] Kim O S, Cho Y J, Lee K,etal.. Introducing EzTaxon-e: a prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species [J]. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2012, 62：716-721.

[12] Tamura K, Stecher G, Peterson D,etal.. MEGA6: Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0 [J]. Mol. Biol. Evol., 2013, 30：2725-2729.

[13] Xu X W, Huo Y Y, Wang C S,etal..Pelagibacteriumhalotoleransgen. nov., sp. nov. andPelagibacteriumluteolumsp. nov., novel members of the familyHyphomicrobiaceae[J]. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2011, 61：1817-1822.

[14] 陆 键，黄 潇，伍贤明，等. 高效烷烃降解菌XCZ的分离鉴定及降解特性[J].土壤，2008，40 (3): 460-464.

[15] Kämpfer P, Young C C, Chu J N,etal..Gordoniahumisp. nov., isolated from soil [J]. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2011, 61: 65-70.

[16] 张 楠,陈波水,方建华,等. 正十六烷降解菌的分离、鉴定及降解特性[J].化学与生物工程,2012, 8 (6): 1672-5425.

[17] 吴佩春,王海涛,刘亚男,等. 海绵中石油降解菌微生物的分离筛选及降解特性研究[J]. 生物技术进展,2014,4 (1):44-48.