RAD18基因rs373572位点多态性与结直肠癌的相关性研究*



RAD18基因rs373572位点多态性与结直肠癌的相关性研究*

顾竹君#王红&刘超乐贻军林云安王文佳

广州医科大学附属广州市第一人民医院消化内科广州消化疾病中心(510180)

*基金项目：2012 年广州市科技计划项目(2060404)

#Email: 448197586@qq.com

背景：RAD18是一种单链DNA结合蛋白，在维持受损DNA的完整性和细胞基因组稳定等方面起有重要作用。目的：研究RAD18基因单核苷酸多态性(SNPs)位点Arg302Gln(rs373572)与结直肠癌易感性及其临床病理特征的关系。方法：提取109例结直肠癌患者和241名健康对照者的外周血基因组DNA，采用PCR测序法对RAD18基因rs373572位点进行基因分型。结果：结直肠癌组与对照组间RAD18基因rs373572位点GG、GA、AA基因型分布差异有统计学意义(P<0.05)，结直肠癌组AA基因型频率显著高于对照组(16.5%对8.7%,P<0.05；校正后OR=2.428, 95% CI: 1.170~5.035)，有远处转移的结直肠癌患者GA基因型频率显著高于无远处转移者(75.0%对41.9%,P<0.05；校正后OR=7.764, 95% CI: 0.927~65.206)。rs373572位点多态性与结直肠癌分化程度、肿瘤部位、Duke分期、淋巴结转移均无相关性(P>0.05)。结论：RAD18基因rs373572位点AA基因型可能是结直肠癌的遗传易感因素，且该位点多态性与结直肠癌的远处转移有关。

关键词结直肠肿瘤；基因，RAD18；多态性，单核苷酸；肿瘤转移

结直肠癌是一种多因素相互作用的复杂疾病，可能的发病因素包括遗传、环境、生活方式等。RAD18作为一种单链DNA结合蛋白，在维持受损DNA的完整性和细胞基因组稳定等方面起有重要作用。研究发现RAD18参与了多条DNA修复通路，如复制后修复(postreplication repair, PRR)[1]、同源重组(homologous recombination, HR)[2]、Fanconi贫血症(Fanconi anemia, FA)通路[3]等，而这些通路作为维持细胞正常增殖、分化、存活、凋亡的重要机制，与肿瘤形成密切相关。本研究旨在探讨RAD18编码基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位点Arg302Gln(rs373572)与结直肠癌易感性及其临床病理特征的关系，为阐明结直肠癌的发生、发展机制以及结直肠癌高危人群的筛查、有效药物靶点的筛选等提供依据。

材料与方法

一、研究对象

收集2010年3月—2014年11月广州市第一人民医院收治的病理学确诊结直肠癌患者109例，患者年龄29~86岁，平均(64.95±12.10)岁，入组前均未接受过化疗或放疗。同期收集来自广东省内、体检结果正常的健康人241名作为对照组，对照者年龄24~85岁，平均(60.50±15.03)岁，无肿瘤病史。研究方案通过医院伦理委员会审查，入组受检者均知情同意。

二、方法

1. 基因组DNA提取：以EDTA-Na2抗凝管采集受检者外周静脉血2 mL，-80 ℃保存待测。按基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]说明书进行操作，提取基因组DNA。

2. RAD18基因rs373572位点基因分型：采用PCR测序法。根据NCBI数据库中的人类基因DNA序列，采用Primer Premier 5.0软件设计引物，由上海英俊生物技术有限公司合成。引物序列：F 5’-ATA CCC ATC ACCCAT CTT C-3’，R 5’-CTG AAA TAG CCC ATTAAC ATA CA-3’，扩增产物 205 bp。反应体系总体积25 μL，内含PCR mix(Takara Bio Company)12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、DNA模板0.5 μL(约20 ng，可根据提取的DNA浓度调整)，以灭菌水补足体积。反应参数：95 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 30 个循环；72 ℃延伸7 min。扩增产物由睿博兴科生物技术有限公司进行测序，计算各基因型和等位基因频率。

三、统计学分析

应用SPSS 12.0统计软件，对结直肠癌组和对照组分别行Hardy-Weinberg遗传平衡检验；计数资料以百分率或构成比表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，计算基因多态性与结直肠癌风险关联程度的OR值及其95% CI，并以性别、年龄、吸烟史、家族史进行校正。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、一般情况

结直肠癌组和对照组样本分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，表明抽样具有代表性。结直肠癌组性别、年龄、吸烟史与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，但一级亲属有消化道肿瘤家族史者的比率显著高于对照组(9.2%对3.7%,P=0.038)(表1)，提示家族史为结直肠癌危险因素，统计分析时应去除此混杂因素的影响。

表1　结直肠癌组与对照组一般情况比较 n(%)

二、RAD18基因rs373572位点测序结果

所有样本均以直接测序进行基因分型，从测序峰值图上读出基因型，纯合子峰为单峰，杂合子峰为双峰。经检测，RAD18基因rs373572位点纯合子基因型为GG和AA，杂合子基因型为GA(图1)。

图1　RAD18基因rs373572位点测序结果

三、RAD18基因rs373572位点多态性与结直肠癌风险的关系

结直肠癌组与对照组间RAD18基因rs373572位点GG、GA、AA基因型分布和G、A等位基因分布差异有统计学意义(P<0.05)。结直肠癌组AA基因型和A等位基因频率均显著高于对照组，经校正后OR值分别为2.428(95% CI: 1.170~5.035)和1.533(95% CI: 1.096~2.144)(表2)。

表2RAD18基因rs373572位点多态性与结直肠癌风险的关系n(%)

rs373572 位点结直肠癌组(n=109)对照组(n=241)P值OR(95%CI)基因型 GG40(36.7)118(49.0)1(参考值) GA51(46.8)102(42.3)0.1251.470(0.898~2.405) AA18(16.5)21(8.7)0.0172.428(1.170~5.035)等位基因 G131(60.1)338(70.1)1(参考值) A87(39.9)144(29.9)0.0121.533(1.096~2.144)

注：OR值经性别、年龄、吸烟史、消化道肿瘤家族史校正

四、RAD18基因rs373572位点多态性与结直肠癌临床病理特征的关系

结直肠癌患者中，有远处转移者与无远处转移者间RAD18基因rs373572位点GG、GA、AA基因型分布差异有统计学意义(P<0.05)，有远处转移者GA基因型频率为75.0%(12/16)，显著高于无远处转移者的41.9%(39/93)，经校正后OR值为7.764(95% CI: 0.927~65.206)。rs373572位点各基因型分布与结直肠癌分化程度、肿瘤部位、Duke分期、淋巴结转移均无相关性(P>0.05)(表3)。

讨论

越来越多的证据表明，肿瘤的发生是具有遗传易感性的个体受有害环境因素作用所致，包括SNPs在内的遗传变异是决定个体对肿瘤易感性的重要因素，如DNA修复基因多态性可影响DNA修复能力，进而影响恶性肿瘤发病[4]。RAD18为一包含RING结构、能与单链DNA结合、具有E3泛素连接酶活性的蛋白，可使多种DNA复制和修复通路的关键蛋白泛素化，目前发现其可能参与了PRR、HR、FA等多条DNA修复通路。如受损DNA在真核细胞进入DNA合成的S期前仍未得到修复，系统将启动PRR通路以顺利完成DNA复制，这一过程的开启主要是由增殖细胞核抗原(PCNA)的泛素化所调控，PCNA经RAD6-RAD18这一E2-E3泛素连接酶复合物催化发生单泛素化后，招募一系列非特异性DNA合成酶至DNA损伤位点，实现DNA损伤后的DNA合成[5]，因此RAD18在DNA修复PRR通路中的作用备受关注。研究[6]证实，提取自人类细胞的RAD6和RAD18蛋白能使PCNA泛素化，上调或下调两者表达可致PCNA的泛素化程度相应升高或降低。此外，本课题小组既往研究还发现RAD18与FA通路关键蛋白FANCD2之间存在关联，可能通过对FANCD2的泛素化调控FA通路功能，从而参与结直肠癌的发生、发展[7-8]。

表3　RAD18基因rs373572位点多态性与结直肠癌临床病理特征的关系(n)

注：OR值经性别、年龄、吸烟史、消化道肿瘤家族史校正

RAD18蛋白编码基因位于3号染色体长臂2区5带(3p25.3)，Arg302Gln(rs373572)位点位于RAD18的核心功能——E3泛素连接酶编码区，故该位点多态性可通过影响RAD18功能而影响其介导的多个DNA复制和修复通路。Kanzaki等[9-10]采用PCR-CTPP(confronting two-pair primer)法对日本人群的RAD18基因rs373572位点进行基因分型，发现AA基因型是结直肠癌和非小细胞肺癌的危险因素，国内则尚未见RAD18基因SNPs与结直肠癌风险相关的文献报道。本研究采用较PCR-CTPP法更权威、准确、快速的直接测序法对结直肠癌患者和健康对照者的RAD18基因rs373572位点进行基因分型，发现结直肠癌组AA基因型频率显著高于对照组(16.5%对8.7%,P<0.05; 校正后OR=2.428, 95% CI: 1.170~5.035)，表明携带AA基因型的个体患结直肠癌的风险增高，与Kanzaki等[9]对日本人群的研究结果相符。然而本研究中对照组的GG、GA、AA基因型频率分别为49.0%、42.3%和8.7%，与Kanzaki等[9]报道的43%、45%和11%略有差异，考虑可能与研究人群不同有关。本研究还发现，有远处转移的结直肠癌患者rs373572位点GA基因型频率显著高于无远处转移者(75.0%对41.9%,P<0.05; 校正后OR=7.764, 95% CI: 0.927~65.206)，表明携带GA基因型的结直肠癌患者发生远处转移的风险增高。本研究未发现rs373572位点多态性与结直肠癌分化程度、肿瘤部位、Duke分期、淋巴结转移之间存在关联，但其他文献报道该位点多态性与淋巴结转移有关，A等位基因频率在有淋巴结转移的结直肠癌患者中显著升高，考虑此位点多态性可能与结直肠癌细胞的侵袭、迁移有关[9]，具体机制有待进一步研究。

综上所述，本研究结果显示RAD18基因rs373572位点多态性与结直肠癌易感性以及肿瘤远处转移相关，AA基因型可能是结直肠癌的遗传易感因素。然而结直肠癌的发生、发展为一涉及多基因突变的复杂的多步骤过程，单一位点多态性并不提示绝对致病性，且本研究样本量偏小、样本来源单一，后续拟扩大样本量、丰富样本来源，联合进行多基因、多位点检测，以进一步明确RAD18基因多态性与结直肠癌的关系，同时以免疫组化、蛋白质印迹法等技术验证RAD18蛋白表达和功能与rs373572位点多态性的关联，为从基因水平揭示结直肠癌的致病机制提供依据。

参考文献

1 Tsuji Y, Watanabe K, Araki K, et al. Recognition of forked and single-stranded DNA structures by human RAD18 complexed with RAD6B protein triggers its recruitment to stalled replication forks[J]. Genes Cells, 2008, 13 (4): 343-354.

2 Yamashita YM, Okada T, Matsusaka T, et al. RAD18 and RAD54 cooperatively contribute to maintenance of genomic stability in vertebrate cells[J]. EMBO J, 2002, 21 (20): 5558-5566.

3 王红. FA信号通路参与大肠癌分子发病机制的实验研究[D]. 广州: 中山大学, 2009.

4 Berwick M, Vineis P. Markers of DNA repair and susceptibility to cancer in humans: an epidemiologic review[J]. J Natl Cancer Inst, 2000, 92 (11): 874-897.

5 Masuda Y, Suzuki M, Kawai H, et al. En bloc transfer of polyubiquitin chains to PCNAinvitrois mediated by two different human E2-E3 pairs[J]. Nucleic Acids Res, 2012, 40 (20): 10394-10407.

6 Bi X, Barkley LR, Slater DM, et al. Rad18 regulates DNA polymerase and is required for recovery from S-phase checkpoint-mediated arrest[J]. Mol Cell Biol, 2006, 26 (9): 3527-3540.

7 乐贻军，王红，钟雄平，等. 结直肠癌细胞中RAD18与FANCD2蛋白相互作用的实验研究[J]. 胃肠病学, 2014, 19 (11): 665-668.

8 钟雄平，陈业金，孔红祥，等．siRNA沉默RAD18抑制结肠癌SW480细胞FANCD2蛋白泛素化并增强其对丝裂霉素C的敏感性[J]. 实用医学杂志, 2013, 29 (11): 1731-1733.

9 Kanzaki H, Ouchida M, Hanafusa H, et al. Single nucleotide polymorphism in the RAD18 gene and risk of colorectal cancer in the Japanese population[J]. Oncol Rep, 2007, 18 (5): 1171-1175.

10Kanzaki H, Ouchida M, Hanafusa H, et al. The association between RAD18 Arg302Gln polymorphism and the risk of human non-small-cell lung cancer[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2008, 134 (2): 211-217.

(2015-04-09收稿；2015-05-04修回)·短篇论著·

Correlation of RAD18 Gene rs373572 Polymorphism with Colorectal CancerGUZhujun,WANGHong,LIUChao,LEYijun,LINYunan,WANGWenjia.DepartmentofGastroenterology,GuangzhouFirstPeople’sHospital,GuangzhouMedicalUniversity;GuangzhouDigestiveDiseaseCenter,Guangzhou(510180)

Correspondence to: WANG Hong, Email: wong.hong@163.com

Background: RAD18 is a single stranded DNA binding protein, which plays an important role in maintaining the integrity of damaged DNA and the genomic stability of cells. Aims: To study the correlation of Arg302Gln (rs373572), a single nucleotide polymorphism (SNP) in RAD18 gene, with the susceptibility and clinicopathological features of colorectal cancer (CRC). Methods: Peripheral blood genomic DNA of 109 CRC patients and 241 healthy subjects were extracted and went through gene sequencing after PCR amplification for RAD18 rs373572 genotyping. Results: Statistically significant differences were found in distribution of RAD18 rs373572 GG, GA and AA genotypes between CRC and control groups (P<0.05); the frequency of AA genotype in CRC group was significantly higher than that in control group (16.5%vs. 8.7%,P<0.05; adjusted OR=2.428, 95% CI: 1.170-5.035).In CRC group, GA genotype was more frequent in patients with distant metastasis than those without (75.0%vs. 41.9%,P<0.05; adjusted OR=7.764, 95% CI: 0.927-65.206). No correlation was found between rs373572 polymorphism and differentiation, location, Duke’s stage and lymph node metastasis of CRC (P>0.05). Conclusions: RAD18 rs373572 AA genotype might be a genetic susceptible factor for CRC, and rs373572 polymorphism is correlated with distant metastasis of CRC.

Key wordsColorectal Neoplasms;Genes, RAD18;Polymorphism, Single Nucleotide;Neoplasm Metastasis

通信作者&本文，Email: wong.hong@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.12.007