2014年山西运城临床患者乙型脑炎病毒E分子生物学特征及基因分型研究

赵秋霞 阴怀清

2014年山西运城临床患者乙型脑炎病毒E分子生物学特征及基因分型研究

赵秋霞 阴怀清

目的 初步了解2014年山西省运城地区病毒性脑炎患者中乙型脑炎病毒E基因分子生物学特征和基因型别分布特征。方法 采集19例临床诊断为病毒性脑炎患者的脑脊液标本, 提取核酸通过巢式聚合酶链式反应(nPCR)扩增乙型脑炎病毒基因片断, 采用生物信息学软件对病毒E基因区段核苷酸和氨基酸序列进行分子生物学特征分析并与通过构建系统进化树与国内外不同年代和地域分离的覆盖5个基因型别的乙型脑炎病毒进行基因型别研究。结果 19例山西运城脑炎患者标本中有2例为乙型脑炎病毒核酸阳性, 基因分型结果显示均为基因Ⅰ型乙型脑炎病毒。结论 2014年山西运城地区病毒性脑炎患者中乙型脑炎病毒为基因Ⅰ型, 与毒力相关的8个位点与乙型脑炎病毒P3一致, 没有发生突变, 不会影响病毒毒力。理论上表明, 目前使用的乙型脑炎病毒疫苗对当地的乙型脑炎病毒仍具有保护力。

虫媒病毒；乙型脑炎病毒；序列分析；种系发生

流行性乙型脑炎又称为日本脑炎(JE), 是由携带乙型脑炎病毒的节肢动物通过叮咬人畜传播造成的传染性疾病。乙型脑炎首次于1924年在日本报道, 此后相继在亚洲以及南太平洋地区传播流行。近年来乙型脑炎不断发生爆发式流行,我国最近的一次乙型脑炎病毒大流行发生在2006年［1］, 山西运城地区发生乙型脑炎80余例, 死亡20余人。乙型脑炎已经成为引起全世界关注的重要的公共卫生问题。

乙型脑炎的病原体为乙型脑炎病毒(JEV), 属于黄病毒科, 黄病毒属。基因组为11 kb的单股正链RNA, 可编码3个结构蛋白：C、M、E, 与病毒致病性和免疫原性重要相关。编码7个非结构蛋白：NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5。根据基因组中编码E蛋白的核苷酸的差异, 将乙型脑炎分为5个基因型, 分别为基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型。乙型脑炎是一种疫苗可预防性疾病, 我国目前使用的乙型脑炎疫苗株P3株和Sa14-14-2株, 此两株病毒株均为基因Ⅲ型乙型脑炎毒株。根据最新的乙型脑炎病毒分子流行病学研究结果显示［2,3］, 目前流行的乙型脑炎病毒优势基因型别已经发生了转化, 由基因Ⅲ型转化为基因Ⅰ型［4,5］。有文献报道,临床出现接种乙型脑炎疫苗后仍感染乙型脑炎病毒的病例,经分子基因特征分析为基因Ⅰ型乙型脑炎病毒感染［6］。因此,开展运城地区乙型脑炎病毒基因分型和分子特征研究对于明确运城地区流行的乙型脑炎病毒基因型别, 了解运城乙型脑炎病毒的分子进化特征, 评估目前使用的乙型脑炎病毒疫苗的免疫保护力的研究具有重要意义。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2014年6～10月, 收集到运城市中心医院临床诊断为病毒性脑炎患者的脑脊液标本19份。

1.2 RNA提取及逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 采用QIAamp Viral RNA Mini Kit(美国QIAGEN公司) 提取患者脑脊液标本中病毒的总RNA, 采用Amersham Bioscience Ready-to-GoTM You First-Strand Beads (美国Amersham Pharmacia Biotech)制备cDNA。取2 μl cDNA做反应模板, 采用巢样PCR方法进行乙型脑炎病毒特异性核酸检测, 引物如下： PEf:ACGTTCTTCAAGTTTACAGCA; PEr：GGAAATGAAGGCTCAATCATGTG；PEfn：GATGTCAATGGC ACATCCAGT; PErn：CGTTCTTCAAGTTTACAGCATTAGC。先依次加入10×Buffer 5 μl、2.5 mmol/L dNTP 5 μl、上下游引物各1 μl、exTaq酶0.75 μl、去离子31.75 μl, 充分混匀, 94℃预变性5 min, 94℃30 sec, 55℃30 sec, 72℃1.5 min, 30个循环, 72℃延伸10 min, 1%琼脂糖电泳检查扩增条带, 用TaKaRa DNA fragment Purification Kit纯化PCR扩增产物, 送上海生工生物公司测序。

1.3 病毒序列分析 本次实验从GenBank中选取覆盖全部5个基因型别的49株乙型脑炎病毒的E基因序列为对照进行序列及进化分析。采用Clustal X(1.83)软件进行序列联配分析, BioEdit软件进行序列编辑, 采用DNASTAR软件进行核苷酸及氨基酸差异度分析, MEGA6完成病毒进化分析, 氨基酸位点对比分析由GENEDOC(3.2)软件完成。

2 结果

2.1 患者标本的分子生物学检测 从19例患者脑脊液标本中提取RNA, 反转录成为病毒基因组cDNA, 采用乙型脑炎病毒E基因的巢式扩增引物, 19份标本中有2份标本为乙型脑炎病毒核酸阳性病例, 阳性率10.5%。

2.2 山西运城乙型脑炎病毒的基因分型研究 从NCBI的GenBank中选择分离自不同地区, 不同时间, 不同宿主, 覆盖全部5个基因型别的乙型脑炎病毒病毒序列总计49株, 构建系统进化发育树进行基于乙型脑炎病毒E基因的分型研究。结果显示：2014年从山西运城地区脑炎患者标本中扩增的2株乙型脑炎病毒病毒株SX1401和SX1402均属于基因型Ⅰ型, 这2株病毒聚类成一个小的分支表现出一定的地域分布特征。

2.3 山西运城乙型脑炎病毒E基因核苷酸序列特征 采用WHO推荐并在中国广泛使用的减毒活疫苗株SA14-14-2和P3为对照, 对山西运城地区病毒性脑炎患者标本扩增的2株乙型脑炎病毒E基因区段进行核苷酸和氨基酸序列的同源性分析, 结果如下：新分离的2株乙型脑炎病毒之间核苷酸和氨基酸同源性为100%；与疫苗株P3和SA14-14-2之间核苷酸同源性分别为87.4%和87.5%, 氨基酸同源性均为97.2%。乙型脑炎病毒E蛋白、囊膜糖蛋白为主要的结构蛋白,影响病毒毒力、入侵和免疫原性。分子量约为53 kDa, 含500个氨基酸残基。将运城地区新分离病毒与乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2和P3的E蛋白氨基酸序列进行比对发现,分别存在13个和10个基酸差异位点。乙型脑炎病毒E蛋白中的一些位点E107、E138、E176、E177、E264、E279、E315、E439是影响乙型脑炎病毒毒力的关键位点, 运城地区脑炎患者乙型脑炎病毒E基因序列与疫苗株P3相比8个关键位点均未发生改变。

3 讨论

乙型脑炎病毒基因型别的分布具有比较明显的地域分布倾向性, 其中基因Ⅰ型和Ⅲ型主要分布于温带和亚热带地区,而Ⅱ型和Ⅳ型主要分布于热带地区, 基因Ⅴ型乙型脑炎病毒是最古老的基因型别。最新的乙型脑炎病毒分子流行病学研究发现, 基因Ⅰ型是最年轻的基因型别, 蕴藏着丰富的相对种群多样性, 在与基因Ⅲ型的竞争中处于优势地位, 在乙型脑炎流行区呈现迅速扩张趋势, 并逐渐替代原有基因型别病毒［4］。

山西省运城市地处黄河沿岸, 是乙型脑炎流行的高发区。文献报道［2］, 运城地区1955～1997共发生乙型脑炎3341例, 死亡711例。2006年［1］, 运城市发生80余例成人型病毒性脑炎爆发流行, 无论患者脑脊液或当地采集蚊虫标本中均同时检测到基因Ⅰ型和Ⅲ型乙型脑炎病毒。本次调查结果显示, 在运城19例病毒性脑炎标本中检测到2株基因Ⅰ型乙型脑炎病毒。提示, 该地区乙型脑炎病毒基因型别与亚洲其他地域一样, 发生了由基因Ⅰ型向基因Ⅲ型别的转换。

乙型脑炎属于疫苗可预防性疾病, 由于乙型脑炎疫苗的广泛应用使得该病在我国已得到有效控制。20世纪60年代,中国使用1949年分离自脑炎患者乙型脑炎病毒毒株P3株研制出灭活疫苗, 一直沿用至今。20世纪90年代, 我国使用中国蚊虫分离的乙型脑炎病毒(SA14株)培育出病毒减毒活疫苗(SA14-14-2株), 上述广泛使用的乙型脑炎疫苗的病毒株均属于基因Ⅲ型乙型脑炎病毒, 因此疫苗对不同基因型乙型脑炎病毒的免疫保护效果更是受到特别关注。乙型脑炎病毒E蛋白、囊膜糖蛋白为主要的结构蛋白, 影响病毒毒力,病毒入侵和病毒的免疫原性, E蛋白有8个重要的氨基酸位点与病毒抗原性密切相关。运城乙型脑炎病毒与疫苗P3株毒力相关的8个氨基酸位点没有变异, 表明在当地目前的乙型脑炎疫苗在理论上仍具有保护效力。

［1］ 尹遵栋, 梁晓峰, 李艺星, 等.运城市2006年流行性乙型脑炎疫情调查分析.中国计划免疫, 2007, 13(3):270-273.

［2］ 马仙发, 李宗民, 刑运华, 等.运城地区1955年至1997年流行性乙型脑炎流行病学分析.中华流行病学杂志, 1998(19):3-6.

［3］ Erlanger TE, Weiss S, Keiser J, et al.Past, present, and future of Japanese encephalitis.Emerg Infect Dis, 2009, 15(1):1-7.

［4］ van den Hurk AF, Ritchie SA, Mackenzie JS.Ecology and geographical expansion of Japanese encephalitis virus.Annual Review of Entomology , 2009(54):17-35.

［5］ Wang HY, Takasaki T, Fu SH, et al.Molecular epidemiological analysis of Japanese encephalitis virus in China.Journal of General Virology, 2007, 88(Pt3):885-894.

［6］ Zhang JS, Zhao QM, Guo XF, et al.Isolation and genetic characteristics of human genotype 1 Japanese encephalitis virus, China, 2009.PLoS One, 2011, 6(1):e16418.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.24.017

2015-03-13］

030001 山西医科大学(赵秋霞)；山西医科大学第一附属医院儿科(阴怀清)

阴怀清