Nrf2基因rs35652124C/T多态性与伴热性惊厥史的难治性颞叶癫痫的相关性研究☆

尹小健刘洲李克深赵斌

·论 著·

Nrf2基因rs35652124C/T多态性与伴热性惊厥史的难治性颞叶癫痫的相关性研究☆

尹小健*△刘洲△李克深△赵斌△

目的探讨核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)基因rs35652124C/T突变和伴热性惊厥史的难治性颞叶癫痫(febrile seizure refractory temporal lobe epilepsy，FRTLE)的相关性。方法通过病例对照研究，收集18例汉族FRTLE患者、166例汉族非同时兼热性惊厥史及难治性的颞叶癫痫（非FR⁃TLE）患者及183例汉族非癫痫患者。使用SNaPshot方法检测患者外周血Nrf2基因rs35652124C/T多态性。结果有热性惊厥(febrile seizure，FS)史的患者占难治性颞叶癫痫(refractory temporal lobe epilepsy,RTLE)的25%，明显高于非RTLE的12.5%(OR：2.3，95%CI：1.07～5.05，P=0.029)。FRTLE组分别与非FRTLE组及非癫痫对照组比较，rs35652124 CC、CT、TT基因型及C、T等位基因间的差异无统计学意义。结论FS可能是RTLE的危险因素，而rs35652124 C/T突变与FRTLE无关。

热性惊厥 难治性癫痫 基因多态性

研究显示，基因遗传、部分性发作、多种癫痫发作类型、病程中发作类型改变等与难治性癫痫(refractory epilepsy,RE)有关，而热性惊厥(febrile seizures,FS)与RE的关系尚有争议[1-2]，与难治性颞叶癫痫(refractory temporal lobe epilepsy,RTLE)的关系鲜有研究，但是，FS患者容易出现海马硬化[3]，而后者是RTLE的常见病理表现，而且，在RTLE及FS患者中，过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)这些氧化应激的标记物明显升高[4-5]，因此，FS可能是RTLE的一个危险因素。核因子E2相关因子2(nuclear factor ery⁃throid 2-related factor 2,Nrf2)是体内广泛存在，作用最强的抗氧化应激调控转录因子。包括GSH-Px在内的众多抗氧化剂是Nrf2基因的下游产物[6]，Nrf2 mRNA表达量在TLE患者海马组织中明显升高[7]，因此，Nrf2可能与RTLE也相关。因此，我们对FS是否是RTLE的危险因素，以及Nrf2基因启动子区rs35652124是否是伴FS的RTLE的危险因素进行研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象 TLE患者为自2010年7月至2012年7月在广东医学院附属医院神经内科就诊的诊断明确用药合理的癫痫患者184例(FRTLE 18例，非FRTLE166例)，所有患者均行24 h动态脑电图(EEG)，头颅CT或MRI检查。入选标准：①汉族；②临床上至少有2次间隔24 h以上，发作明确的痫样发作；③发作间期或发作期脑电图显示颞部导联棘波、尖波、棘慢、尖慢波发放；④CT或MRI排除进行性的神经系统病变和占位病变；⑤根据发作类型，正确选择AED至少治疗2年。排除标准：①误诊；②发作分型不确切；③选药不当；④用药量不足；⑤依从性差。

依照2010年国际抗癫痫联盟关于RE的定义[8]将癫痫患者分为难治性癫痫组和药物反应组。难治性癫痫定义为2种正确选择、可耐受的抗癫痫药物单药或联合治疗仍未能达到无发作的癫痫。其中癫痫“无发作”被定义为无癫痫发作期至少3倍于治疗前最长发作间隔期(依过去12个月中的情况进行判定)或者12个月，以时间相对长者为准。

对照组为在广东医学院附属医院体检中心体检的对象183例，本人及所在家系三代以内没有癫痫发作史，本人亦无神经系统疾病病史。

所有受试者均经知情同意，并经广东医学院附属医院医学研究伦理委员会同意。

1.2 方法

1.2.1 一般资料 收集研究对象的年龄、性别，TLE患者还要收集热厥史，头影像资料。

1.2.2 基因组DNA提取 采早晨肘部静脉血5 mL于抗凝管中，用血液基因组DNA快速抽提试剂盒(上海生工)，提取外周血白细胞的基因组DNA，DNA的浓度用紫外分光光度计测定。

1.2.3 SNP分型 参考本课题组[9]及其它课题组的方法[10]，rs35652124多态性分析由上海天昊遗传分析中心协助完成，利用SNaPshot SNP分型技术对约136个样本进行SNP位点分型。引物用在线Prim⁃er3软件设计(http://frodo.wi.mit.edu/)，PCR扩增引物(F:CTCACTTTACCGCCCGAGAATG，R:CGCTTTG⁃GTGGGAAGAGGTTCT)，紧邻SNP位点的延伸引物(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTGGAGACACGTGGGAGTTCAGAGG)。①PCR反应：反应体系(20 μL)包含1×HotStarTaq buffer，3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP，1 U HotStarTaq polymerase(Qiagen Inc.)，1 μL样本DNA和2 μL多重PCR引物。PCR循环程序：95℃2 min；94℃20s,65℃-0.5℃/cycle 40 s,72℃1 min 30 s，共11循环；94℃20 s,59℃30 s,72℃1.5 min，共24循环；72℃2 min;4℃冷却。②PCR产物纯化：15μl PCR产物中加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，37℃温浴1 h，75℃灭活15 min。③延伸反应：延伸反应体系(10 μL)包括5 μL SNaPshot Multiplex Kit(ABI)，2 μL纯化后多重PCR产物，1 μL延伸引物混合物，2 μL超纯水；PCR循环程序：96℃1 min；96℃10 s，55℃5 s，60℃30 s，共28循环；4℃冷却。④延伸产物纯化：在10 μL延伸产物中加入1U SAP酶，37℃温浴1 h，75℃灭活15 min。⑤延伸产物测序：取0.5 μL纯化后的延伸产物，与0.5 μL Liz120 SIZE STANDARD，9 μL Hi-Di混匀，95℃变性5 min后上ABI3730XL测序仪，在测序仪上收集的原始数据用GeneMapper 4.1(Ap⁃pliedBiosystems Co.,Ltd.,USA)来分析。

1.3 统计分析用SPSS17.0软件进行分析，计量资料用Mann-Whitney检验，计数资料较采用fisher确切概率或卡方检验。检验研究对象是否符合Har⁃dy-Weinberg平衡。检验水准α=0.05。

2 结果

表1 临床资料

2.1 临床资料本研究共纳入TLE研究对像有184例，其中伴热性惊厥的RTLE(FRTLE)有18例，其他166例，非癫痫对照组183例。与非FRTLE组，两组在年龄、性别、癫痫持续状态史、头CT或MRI异常比较时，差异无统计学意义(P＞0.05)。而与非癫痫的对照组比较，FRTLE患者的年龄更小(P＜0.05)（见表1）。

2.2 热性惊厥与难治性颞叶癫痫的关系为了明确FS是否是RTLE的危险因素，我们将TLE是否是难治型、伴FS病史分为4个组进行分析。结果显示，FS在RTLE中占的比例为25%，在非TRTLE中为12.5%，两者比较，差异有统计学意义（OR：2.3,95%CI：1.07～5.05,P=0.029）。

2.3 Hardy-Weinburg平衡吻合度检测FRTLE组、非FRTLE组、非癫痫对照组人群的rs35652124 C/T基因型分布经χ2检验均符合Har⁃dy-Weinburg平衡，具有群体代表性(见表2)。

2.4 Nrf2基因rs35652124 C/T位点分布FRTLE组CC、CT、TT基因型分别6、5、7例；非FRTLE组分别为34、79、53例，对照组分别为45、86、52，FR⁃TLE组分别与非FRTLE组及对照组比较，总体差异无统计学意义。FRTLE组等位基因C、T频率分别为47.2%(17/36)、52.8%(19/36)，非FRTLE组分别为44.3%(147/332)，55.7%(185/332)，对照组分别为48.1%(176/366)，51.9%(190/366)，FRTLE组分别与非FRTLE组及对照组比较，差异也无统计学意义（见表3）。

3 讨论

本研究通过病例对照研究发现，FS可能是RTLE的发病的影响因素，而Nrf2基因rs35652124-C/T多态性与FRTLE的发病无关。

我们的研究证实了FS可能是RTLE的病因，Scantlebury[11]与McClelland[12]在他们综述中提出假设，FS特别是延长型FS可能与RTLE有关。FS是影响儿童的常见神经系统疾病，在伴FS的TLE患者的脑标本中发现，他们海马中的颗粒细胞丢失更明显[13]，在动物实验中也发现，诱导FS发作后，动物会表现为学习和记忆功能受损及相应的海马MRI T2相的信号增长[14]。这些都提示FS对海马产生了损害，而海马病变是RTLE的主要病理表现[15]，因此，FS可能是通过损伤海马，从而导致RTLE。然而Sànchez报道[16]FS与伴海马硬化的内侧TLE预后无关，Savitr[17]的研究却发现，FS与CA4区海马神经元丢失是TLE预后良好的因素，但是作多因素回归分析后这种作用消失。在我们的研究中，FS是作为病史诊断，部分患者或家属在回忆时可能存在偏差，从而造成偏移。而且那些发作持续时间更长，发作次数更多的FS更容易被记起，因此，这部分病人被诊断为延长型FS的可能性更大，这也可能是我们发现FS与RTLE相关，与其它研究结果不一致的原因。

表2 Nrf2基因rs35652124 C/T基因型Hardy-Weinberg遗传平衡检验

表3 Nrf2基因rs35652124 C/T基因型及等位基因频率

Cardenas等[18]认为，氧化应激与RE有密切关系。而Nrf2是体内抗氧化应激调控转录因子。Nrf2通过与胞浆蛋白Keap1以及抗氧化反应元件相互作用，启动下游编码抗氧化蛋白和II相解毒酶的基因表达，发挥细胞保护作用。Nrf2介导的抗氧化反应是一种主要的细胞防御机制。Nrf2缺失或激活障碍，可加重氧化应激源的细胞毒性，导致细胞功能障碍、凋亡甚至死亡。众多研究显示，通过激活Nrf2反应，减少氧化应激，保护神经元，对阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病有效。Nrf2与FS的关系尚未见研究，然而FS患者存在明显的氧化应激状态[19]。而Nrf2的mRNA在癫痫患者海马组织中高表达，在诱惑的癫痫状态小鼠脑中，Nrf2的表达量在72小时逐步升高，并且受其调节的血红素加氧酶-1、醌NADH脱氢酶1、微粒体谷胱甘肽S-转移酶等表现类似，然而，注射Nrf2转染的腺病毒后，小鼠的癫痫发作次数明显下降，而且小胶质细胞激活明显减少，有更多的海马神经元存活[7,20]。说明Nrf2被痫性发作激活，并且进一进上调其控制的下游抗氧化的各种酶。rs35652124位于Nrf2基因启动子区，能调控Nrf2的表达[21]，其多态性的变化，可能会影响到体内氧化应激产物的清除，从而导致FS及RTLE的发生。已经有研究显示，rs35652124与与白癜风[21]、血管功能[22]及血压与心血管病的病死率[23]有关。因此，我们推测rs35652124可能是FRTLE的遗传易感因素，然而我们的研究并没有发现rs35652124 C/T与FRTLE有关。目前尚无Nrf2基因多态性与癫痫的相关性研究的报道，故我们无法找到相关的研究进行比较。然而在欧洲人群中，包含rs35652124、rs6706649、rs6721961三个启动子基因多态位点在内的AGC单倍体能减少帕金森患的发病风险[24]，而该结果在台湾人群未能重复[25]。因此，不同人群之间存在遗传异质性会影响研究结果的一致性。其次，FRTLE是一种复杂的多基因疾病，还受基因-基因及基因-环境交互作用的影响，因此，单一基因的位点的变化可以还不足以导致疾病的发生。最后，同时符合FRTLE四个条件的病例较少，我们的样本量只有18例，还可能没有反映出rs35652124 C/T与FRTLE的真实关系。

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R742.1

A

2014-08-25）

（责任编辑:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.05.011

☆ 国家自然科学基金（编号：31171219）

* 暨南大学附属第一医院（广州 510630）

△ 广东医学院附属医院神经内科

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