替普瑞酮及雷贝拉唑对急性胃黏膜损伤大鼠TFF3表达的研究

张宏伟，石　莎，卢克美

(聊城市人民医院1.药剂科;2.消化内科,山东 聊城　252000)



替普瑞酮及雷贝拉唑对急性胃黏膜损伤大鼠TFF3表达的研究

张宏伟1，石莎2，卢克美2

(聊城市人民医院1.药剂科;2.消化内科,山东 聊城252000)

摘要:目的 研究替普瑞酮及雷贝拉唑对无水乙醇诱发大鼠急性胃黏膜病变的保护性作用及三叶草因子3(TFF3)的表达。方法将大鼠按体重随机分为5 组，分为正常对照组、模型组、替普瑞酮治疗组、雷贝拉唑治疗组、替普瑞酮联合雷贝拉唑治疗组(联合治疗组)，每组8 只。用无水乙醇制备大鼠急性胃黏膜病变模型，苏木精—伊红染色观察各组大鼠胃黏膜组织病理学改变，免疫组织化学法测定各组大鼠胃黏膜TFF3的表达情况。结果与模型组比较，各药物治疗组胃黏膜溃疡指数明显减少，有显著性差异(P<0.01)；与替普瑞酮治疗组比较，联合治疗组胃黏膜溃疡指数明显减少，有统计学意义(P<0.05)；与雷贝拉唑治疗组比较，联合治疗组胃黏膜溃疡指数明显减少，有显著性差异(P<0.01)。HE染色结果，与正常对照组比较，模型组大鼠的胃黏膜表面上皮细胞缺失，伴随大量炎症细胞浸润，肌层和浆膜被破坏；与模型组比较，雷贝拉唑、替普瑞酮治疗组及联合治疗组的大鼠胃黏膜表层上皮细胞缺失减少，黏膜腺体重现，浆膜结构较完整，且炎症细胞较少。免疫组织化学结果，与正常对照组比较，模型组及各药物治疗组胃黏膜TFF3的表达显著增多(P<0.05)。与雷贝拉唑组比较，联合治疗组大鼠胃溃疡周边TFF3的阳性细胞密度明显增加(P<0.05)。结论替普瑞酮与雷贝拉唑可能通过上调 TFF3 的表达改善无水乙醇所致大鼠胃黏膜组织损伤，促进胃黏膜的愈合，对大鼠急性胃黏膜病变起到保护作用。

关键词：替普瑞酮；雷贝拉唑；急性胃黏膜病变；三叶草因子3；保护性作用

急性胃黏膜病变(acute gastric mucosal lesion，AGML)是以胃黏膜发生不同程度糜烂、浅溃疡和出血为特征的病变。目前临床主要见于严重创伤、危重疾病及心理障碍等应激情况下胃黏膜的急性病变，国内诊断更多的是依靠临床表现，极其容易被忽视而导致严重的后果[1]；应激性胃黏膜病变是颅脑损伤的常见并发症，发生率为16%～47%，严重影响患者的预后，甚至危及患者的生命[2]。三叶因子家族(trefoil factor famuly, TFF)主要由胃肠道黏液细胞分泌的小分子多肽组成，三叶草因子3(TFF3)是TFF成员，TFF3具有抗蛋白酶水解、抗酸消化的特征，对胃肠黏膜的损伤、修复、增殖、恶变都有着重要的关系,如今还证实其可以促进眼角膜的伤口愈合[3]。

众所周知，雷贝拉唑是一种质子泵抑制剂，替普瑞酮是胃黏膜保护剂的一种，两者均可以对急性胃黏膜病变起着治疗作用，但其作用机制与TFF3之间是否有关系目前国内外未见相关报道。本研究拟观察替普瑞酮联合雷贝拉唑对大鼠急性胃黏膜病变组织的保护作用；并探讨其保护机制是否与TFF3的表达有关。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物雄性Wistar大鼠，体重190～220 g，40只，由山东大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK(鲁)20120005。

1.1.2主要仪器及试剂替普瑞酮胶囊(每粒50 mg，卫材药业有限公司，批号：130482A)，雷贝拉唑肠溶片(每片10 mg，卫材药业有限公司，批号：120626A)，兔抗人TFF3 多克隆抗体、S-P 试剂盒、枸橼酸抗原修复缓冲液(武汉博士德生物工程公司)，DAB 染色剂(福州迈新生物技术开发公司)。石蜡切片机(美国820型AO切片机)；低温离心机(北京四环科学仪器厂有限公司)；恒温水浴箱(中国江苏)；全自动γ放免计数仪(上海核子检测仪器厂)；奥林巴斯DP73显微镜成像系统；图像分析软件Imagepro-Plus 6。

1.2方法

1.2.1动物模型制备物大鼠适应性饲养1周，室温在22～25℃，光照时间12 h，实验前禁食24 h，不禁水，药物灌胃6 h后进食。按体重随机分为5 组，每组8 只，分别为正常对照组、模型组、替普瑞酮治疗组、雷贝拉唑治疗组、替普瑞酮联合雷贝拉唑治疗组(联合治疗组)。正常对照组以生理盐水(NS)代替药物灌胃；模型组为无水乙醇1 mL灌胃6 h后观察；雷贝拉唑治疗组：无水乙醇1 mL灌胃6 h后,上午9点20 mg·kg-1灌混悬液1 mL灌胃，持续3 d；替普瑞酮治疗组：无水乙醇1 mL灌胃6 h后，下午3点200 mg·kg-1灌混悬液1 mL灌胃，持续3 d；联合治疗组：无水乙醇1 mL灌胃6 h后，上午9点雷贝拉唑20 mg·kg-1，下午3点替普瑞酮200 mg·kg-1分别灌胃，持续3 d。

1.2.2测定胃黏膜损伤指数大鼠上腹部正中切口，将胃完整地切除。切下的胃在室温下浸于10 mL生理盐水中，然后沿着胃小弯切开胃并外翻，将胃内容物洗净。糜蛋白酶及PBS缓冲液冲洗掉表面血迹及黏液，在10倍放大镜下计数腺胃区点线状糜烂、出血情况，按Guth[4]标准评估胃黏膜损伤并累计积分：损伤范围<1 mm(包括糜烂点)计1分；1 mm≤损伤范围<2 mm计2分；2 mm≤损伤范围<3 mm计3分；3 mm≤损伤范围<4 mm计4分；损伤范围≥4 mm计5分；损伤宽度>2 mm者，分值×2。计算溃疡指数(ulcer index,UI),全胃各病灶得分之总和即为UI。

1.2.3组织病理学观察以胃黏膜糜烂部位为中心修剪胃壁组织(正常组在胃前壁近幽门处取组织),留取组织块约1.00 cm×1.00 cm 大小，10% 中性甲醛固定，按照常规梯度乙醇脱水,二甲苯透明，石蜡包埋, 5 μm厚度连续切片，分别作HE(苏木素—伊红)染色和免疫组化使用；切片常规脱蜡、染色、脱水、透明、封固，光镜下(×400倍)观察胃黏膜组织的炎症情况。

1.2.4免疫组化法采用免疫组织化学S-P 法，DAB 染色。切片染色前根据抗体要求行枸橼酸缓冲液高温高压抗原修复。余具体操作过程按试剂盒说明书完成, 并设立阳性对照和阴性对照(以PBS缓冲液代替一抗)，在光镜下观察阳性反应呈棕黄色。用奥林巴斯DP73显微镜成像系统；图像分析软件Image pro-Plus 6在计算机上进行观察：(1)TFF3的判断标准：以胞浆内出现棕黄色颗粒视为阳性细胞, 每张切片随机选择10 个高倍视野, 计数总细胞数以及阳性细胞数, 并计算阳性细胞率。以≥10%阳性细胞为阳性,<10%为阴性；(2)用成像系统在显微镜下随机圈定面积,在高倍镜下计数所选区域阳性细胞数, 通过计算阳性细胞的数密度对不同部位胃黏膜进行统计分析；(3)阳性细胞数密度=TFF3阳性细胞数目/所选胃黏膜面积。

1.3统计学分析 采用SPSS14.0统计软件分析数据观测资料主要为计量数据，均计算均数±标准差，多组间比较为单因素方差分析，两两比较为LSD-t检验。均以双侧P<0.05为有统计学意义。

2结果

2.1各组大鼠胃黏膜损伤指数与模型组UI比较，正常对照组、雷贝拉唑组、联合治疗组UI显著降低(P<0.01)，替普瑞酮组UI降低(P<0.05)。与替普瑞酮组及雷贝拉唑组 UI比较，联合治疗组 UI降低(P<0.01)，见表1。

2.2HE 染色观察大鼠胃黏膜的组织形态学正常对照组大鼠胃组织结构正常，胃黏膜表面光滑，皱襞整齐清晰，未见糜烂。模型组的大鼠胃黏膜面表层可见坏死组织及其下面的肉芽组织，伴随大量炎症细胞浸润，肌层和浆膜被破坏，腺体间质充血、水肿，有新生小毛细血管形成。与模型组比较，雷贝拉唑、替普瑞酮组及联合治疗组的大鼠胃黏膜表层坏死组织较少，黏膜腺体重现，其下层接近正常，间质充血水肿减轻、浆膜结构较完整，且炎症细胞及渗出物较少，见图1。

表1　各组大鼠胃黏膜损伤指数的结果

注：与模型组比较，aP<0.01,bP<0.05；与替普瑞酮及雷贝拉唑组比较，cP<0.01。

2.3免疫组化染色观察大鼠胃黏膜 TFF3的表达 正常对照组大鼠 TFF3 表达阴性。与模型组比较，替普瑞酮组、雷贝拉唑组及联合治疗组大鼠胃溃疡周边TFF3的阳性细胞密度增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。与雷贝拉唑组、替普瑞酮组比较，联合治疗组大鼠胃溃疡周边TFF3的阳性细胞密度增加，差异有统计学意义(P>0.05)，见表2及图2。

表2　各组大鼠胃黏膜TFF3阳性细胞数密度的变化(cells/1000 μm2)

注：与模型组比较，aP<0.05；与替普瑞酮及雷贝拉唑组比较，bP<0.05。

3讨论

急性胃黏膜病变出现迅速，发病率高，有着潜在的致命性威胁，已经逐渐成为社会关注的课题之一。急性胃黏膜病变的发生机制仍然不明确，但是相关研究表明与胃黏膜炎症反应失控密切相关[5]。三叶草因子家族就是其中的保护性因子，TFF3( trefoil factor family 3)是三叶因子家族中的一员，正常情况下主要分布于肠黏膜，当胃黏膜受损时，胃黏膜出现TFF3的高表达[6],正常胃黏膜仅含有少量的TFF3[7]。

本研究通过用无水乙醇制备大鼠急性胃黏膜病变模型，与正常对照组比较，模型组大鼠的胃黏膜表面上皮细胞缺失，伴随大量炎症细胞浸润，肌层和浆膜被破坏；模型组大鼠95%酒精造模导致的急性胃黏膜损伤的评分结果与易受乡等[8]相似；而且在胃黏膜损伤处TFF3阳性细胞表达，与正常对照组比较明显增多。

替普瑞酮为萜烯类药物，是一种新型的胃黏膜保护剂，临床上用于治疗各种原因引起的胃溃疡及慢性胃炎等胃黏膜损伤，与抑酸剂联用治疗消化道溃疡等。雷贝拉唑是一种质子泵抑制剂，可提高胃液pH值，阻止酸对胃黏膜的侵蚀，其在酸性溶液中不稳定，适宜于制备成肠溶制剂[9]。制酸剂和黏膜保护剂都能促进溃疡愈合，黏膜保护剂能明显提高溃疡的愈合质量。雷贝拉唑与替普瑞酮可以通过多种途径对NSAIDs 所致胃损伤起保护作用[10]，王晗等[11]证实，替普瑞酮和雷贝拉唑可以通过抑制occludin 和ZO-1 的表达减少，从而改善黏膜屏障功能。替普瑞酮具有促进NO合成及诱导HSP等作用[12]，但是其与TFF3之间的关系未见报道。

本研究证实与模型组比较，各药物治疗组胃黏膜溃疡指数明显减少；与替普瑞酮或雷贝拉唑治疗组比较，联合治疗组胃黏膜溃疡指数明显减少。与模型组比较，雷贝拉唑、替普瑞酮治疗组及联合治疗组的大鼠胃黏膜表层上皮细胞缺失减少，黏膜腺体重现，浆膜结构较完整，且炎症细胞较少。免疫组织化学结果，与正常对照组比较，模型组及各药物治疗组胃黏膜TFF3阳性细胞显著增多。

三叶因子对胃黏膜的保护作用机制众多[13]，其可以和黏蛋白相互作用增强胃黏膜防御屏障；还通过E-钙黏连素/β-连接素促进细胞迁移来修复细胞的损伤[14]；还可以通过iNOS和EGF-R等参与血管生成。本试验证实TFF3在乙醇引起的急性胃黏膜损伤过程中起到胃黏膜的保护作用，应用外源性TFF3 能减轻急性胃黏膜的损伤[15]。而TFF3究竟通过何种途径发挥其胃黏膜损伤作用的，至今还未见报道，以后我们还将深入研究。

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doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.009

基金项目:聊城市科学技术攻关计划项目(No 2014-2-134)

(收稿日期：2015-07-29，修回日期：2015-08-14)

Expression of TFF3 in rats with acute gastric mucosal
lesion treated by Teprenone and Rabeprazole

ZHANG Hong-wei1, SHI Sha2,LU Ke-mei2

(1.DepartmentofGastroenterology;2.DepartmentofPharmacology,

LiaochengPeople’sHospital,Liaocheng,Shandong252000,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the expression of TFF3 and the protective role of Teprenone and Rabeprazole in rats with acute gastric mucosal lesion. Method Forty wistar male rats were randomly assigned into normal control group, model group, teprenone group, rabeprazole group and teprenone/rabeprazole group, with 8 rats in each group. Acute gastric mucosal lesion model was induced by absolute ethylalcohol. Gastric tissue pathological changes were performed by hematoxylineosin staining，and gastric ulcer index was evaluated．Expression of TFF3 in gastric mucosa was detected by immune histochemical method. Results (1) UI of drug treatment groups was significantly lower than that of model group(P<0.01); UI of combination group was lower than that of teprenone group(P<0.05);UI of combination group was lower than that of rabeprazole group(P<0.01).(2) Hematoxylineosin staining results were as follows:Compared with control group, epithelial cells were deficient on gastric mucosa surface in model group, with a large number of inflammatory cells infiltration as well as muscularis and serosa destroyed; By comparison with model group, in rabeprazole group, teprenone group and rabeprazole/teprenone group deficiency of epithelial cells of gastric mucosa surface was less, mucous glands reappeared, and serous membrane structure was relatively complete with less inflammatory cells and exudate.(3)Immunohistochemical results were as follows:Expression of TFF3 positive cells in model group and drug intervention group was significantly increased, which was significantly higher than that in normal control group(P<0.05). ConclusionRabeprazole and teprenone may protect gastric mucosa tissues by raising TFF3 expression，promote the healing of gastric mucosa and alleviate the acute gastric mucosa injury in rats.

Key words:teprenone;rabeprazole;acute gastric mucosal lesion;trefoil factor 3;protection