bFGF基因转染MSC目的基因检测

王彦生 于宁

bFGF基因转染MSC目的基因检测

王彦生 于宁

【摘要】目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因外源性转染到MSC（骨髓间充质细胞）后，bFGF基因的表达情况。方法 选取SD大鼠，获取骨髓间充质细胞，分为对照组、阴性对照组（转染外源性GFP）和实验组（外源性bFGF转染MSC），经过体外培养后，应用RT-PCR和ELISE法检测各组MSC的bFGF基因阳性表达情况。结果 RT-PCR法显示实验组bFGF基因表达量（0.73±0.15）高于对照组和阴性对照组（P＜0.05）。ELISA法显示bFGF基因表达主要集中在胞浆，实验组bFGF基因表达量[上清为（5.38±0.45）ng/L，胞浆为（8.27±0.82）ng/L]高于其他两组（P＜0.05）。结论 采用病毒介导基因转染技术能够将外源性bFGF转染至MSC，并能够成功实现bFGF基因表达。

【关键词】bFGF基因；骨髓间充质细胞；细胞转染

【

作者单位：110024 沈阳医学院附属中心医院手外科

Detection of bFGF Transfection on MSC Gene

WANG Yansheng YU Ning, Hand Surgery Department, Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College, Shenyang 110024, China

[Abstract]Objective To discuss the expression of bFGF gene, after basic fibroblast growth factor (bFGF) exogenous transfection to MSC (bone marrow cells). Methods SD rats were selected. The ectomesenchymal cells were obtained from bone marrow. They were divided into control group, negative control group (transfection exogenous GFP) and experimental group (exogenous bFGF transfection on MSC), in vitro culture, bFGF gene positive expression of MSC were detected by the method of RT-PCR and ELISE in each group. Results RT-PCR showed that bFGF gene expression quantity was (0.73±0.15) in experimental group, it was significantly higher than the control group and the negative control group (P<0.05). ELISA showed that bFGF gene expression was mainly in the cytoplasm, the experimental group bFGF gene expression quantity were [supernatant (5.38±0.45)ng/L, cytoplasm (8.27±0.82)ng/L], it was significantly higher than the other two groups (P<0.05). Conclusion The application of virus mediated gene transfection to transfect exogenous bFGF to MSC can successfully achieve bFGF gene expression.

[Key words]BFGF gene, Bone marrow mesenchymal cells, Cell transfection

bFGF具有诸多生物学功效,是形成新生血管的特异性促进因子，而且能够调控MSC增殖和定向分化[1]。本实验探讨将病毒作载体，通过将外源性bFGF基因染入到MSC后，通过观察bFGF基因的表达，为更为深入的研究bFGF提供相关动物实验基础。

1　材料和方法

1.1 实验动物

6只近交系SD大鼠均来源与中国医科大学，体重为（160±10）g。

1.2 主要试剂及仪器

bFGF片段（武汉博士德生物）；DMEM液、乙二胺四乙酸、蛋白酶（美国GIBCO）；PCR仪（美国ABI公司）；核酸电泳仪（北京六一厂）；凝胶成像仪（美国 BIO公司），细胞转染试剂盒、ELISA试剂盒(美国R&D公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 细胞传代培养及转染 断颈处死SD大鼠后，消毒，取股骨和胫骨，去掉骨表面软组织，完全显现骨髓腔，用DMEM液冲洗髓腔后，抽取骨髓并制成细胞悬液，离心去除上清，添加完全培养液，细胞重悬后，用培养瓶接种细胞悬液，室温下放置到CO2培养箱中，每72 h换液1次，至细胞融合超过80%后，添加乙二胺四乙

酸、胰蛋白酶消化后，进行传代培养（1∶3）。取3代细胞，分为对照组、阴性对照组和实验组，实验组细胞悬液，滴加到培养孔中后，加入bFGF纯化液和培养液转染2 h后进行48 h细胞培养，每24 h更换1次培养基。对照组仅使用培养液，阴性对照组添加纯化GFP液和培养液。

1.3.3 检测指标及方法 应用RT-PCR和ELISA法检测MSC细胞中bFGF基因的表达情况。

1.4 统计学方法

应用SPSS 15.0软件，组间计量数据比较用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

RT-PCR检测发现对照组bFGF基因表达量为（0.34±0.11）ng/L，阴性对照组表达量为（0.33±0.12）ng/L，实验组表达量为（0.73±0.15）ng/L，实验组bFGF阳性表达量高于其两组（P＜0.05）。ELISA法检测显示对照组上清中bFGF基因表达量为（0.18±0.07）ng/L，胞浆表达量为（0.21±0.10）ng/L，阴性对照组bFGF基因表达量为（0.21±0.09）ng/L，胞浆表达量为（0.29±0.10）ng/L，实验组bFGF基因表达量为（5.38±0.45）ng/L，胞浆表达量为（8.27±0.82）ng/L，实验组bFGF基因表达量高于另外两组（P＜0.05）。

3　讨论

bFGF血管形成的重要诱导因子之一，其对于血管生成的作用备受关注[2]。本实验通过病毒载体将外源性bFGF基因成功转入到MSC内，通过RT-PCR及ELISE检测证实，转染细胞能够bFGF基因阳性部位为细胞浆，MSC转染后其细胞内外均可出现bFGF蛋白阳性表达，并且其bFGF阳性表达量高于对照组及阴性对照组（P＜0.05），提示外源性bFGF基因转染大鼠MSC后，能够得到目的基因表达，且能够保有生物学活性，促进细胞自身增殖。综上所述，病毒载体基因转染法能够将bFGF基因导入到MSC中，使转染MSC中bFGF基因持续高表达。

参考文献

[1]张金池，吴明祥，王玉龙，等. 人碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的研究[J]. 中华实验外科杂志，2010，27(10)：1436-1438.

[2]蔡弢艺，陈雄生，贾连顺，等. 碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞的表型变化[J]. 中国组织工程研究，2014，19(23)：3727-3731.

·研究分析·

项目基金：辽宁省科学技术计划项目（编号：2012020120-217）

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.18.035

【文章编号】1674-9308（2015）18-0055-02

文献标识码】B

【中图分类号】R394.3