脊髓损伤后早期小鼠肠道功能的变化①

梁羽，李灿，罗兰，杨拯，王强，马俊，王洋洋，张璐璐，杨维，易芳

脊髓损伤后早期小鼠肠道功能的变化①

梁羽，李灿，罗兰，杨拯，王强，马俊，王洋洋，张璐璐，杨维，易芳

目的 探讨脊髓损伤后短期内小鼠肠道功能的变化。方法将105只昆明种小鼠随机分为正常组(A组，n=30)、假手术组(B组，n=30)和模型组(C组，n=45)。A组不作处理，B组仅暴露脊髓，不夹持。C组采用动脉瘤夹夹持T10处脊髓，复制脊髓损伤模型。分别于术后12 h、24 h、48 h测定小鼠回肠肌电慢波及平滑肌收缩力，并做回肠HE染色。结果脊髓损伤后12 h、24 h、48 h，C组小鼠肌电频率和振幅低于A组和B组(P<0.05)，收缩力振幅低于A组和B组(P<0.05)，但24 h、48 h后收缩力频率高于A组和B组(P<0.05)。C组各时间点肠黏膜评分均较A组和B组高(P<0.05)。结论小鼠脊髓损伤后早期，肠道平滑肌肌电活动减弱，收缩力减小，肠黏膜轻度损伤。

脊髓损伤；肠道；功能障碍；小鼠

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是目前临床上常见的中枢系统损伤疾病，可导致患者运动功能丧失，神经调节紊乱。脊髓损伤后的并发症，肠道功能障碍更是对患者造成严重影响。脊髓损伤患者常出现自主神经反射异常，肠道顺应性降低[1-2]。探究脊髓损伤后肠道功能障碍的作用机理，可为脊髓损伤患者的用药提供指导。然而，目前在这方面的探讨尚显不足，且大多着眼于损伤长时间内的肠道功能变化及菌群移位变化[3-6]，对脊髓损伤后短期肠道功能变化的探讨较少。本文就脊髓损伤后早期小鼠肠道功能的变化进行研究，为脊髓损伤后肠道功能障碍的机制探讨提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

健康成熟的昆明种小鼠105只，体质量24~26 g，购自成都达硕生物科技有限公司，许可证号：SCXK(川)2008-24。造模前12 h，禁食但让其自由饮水。按随机数字表，将105只小鼠单纯随机分为正常组(A组，n=30)、假手术组(B组，n=30)和模型组(C组，n=45)。各组又分12 h、24 h、48 h 3个亚组，A组、B组每个亚组各10只，C组每个亚组各15只。

1.2 主要试剂和仪器

氯化钠注射液：贵州科伦药业有限公司，批号B121003U。5%葡萄糖注射液：安徽双鹤药业有限公司，批号100829 6K。注射用青霉素钠：中诺药业(石家庄)有限公司，批号016130114。水合氯醛(chloral hydrate)：成都市科龙化工试剂厂，批号20100920。TC-120智能程控生物组织自动脱水机：泰维科技。KD-BM生物组织包埋机：浙江省金华市科迪仪器设备有限公司。BL-420E+生物机能实验系统：成都泰盟科技有限公司。自制动脉夹。

1.3 模型制备

A组小鼠不予任何处理；B组和C组小鼠在用10%水合氯醛0.004 ml/g麻醉完全后，呈俯卧位固定于手术台，背部备皮，常规消毒铺巾，依次剥开背部皮肤、筋膜，去除T10段肌肉、棘突、椎板，暴露脊髓。B组小鼠不予夹持，而C组用改良自制动脉瘤夹(标定力量为20 g)横行压迫T10处脊髓，夹至脊髓直径的1/2，时长为30 s[7]。见小鼠后腿蹬腿、摆尾以及夹持处脊髓充血则示造模成功。缝合后，注射等量5%葡萄糖、氯化钠注射液及8×104U青霉素钠。

1.4 肠道平滑肌肌电测定

分别于术后12 h、24 h、48 h，取A组、B组各10只小鼠，C组15只小鼠，在麻醉后，将其呈仰卧位固定，常规消毒铺巾，打开腹腔，在回盲部以上2 cm肠管肌层插入电极，连接BL-420E+生物机能实验系统，约10 min后开始记录肌电，参数选择：扫描速度1.00 s/div，电增益2 mV，时间常数3 s，高频滤波5 Hz，连续记录30 min。

1.5 肠道平滑肌收缩力测定

在各测试时间点，取A组、B组小鼠各10只，C组15只，将其麻醉后，打开腹腔，剪取距回盲部以上2 cm处回肠，将其固定于恒温平滑肌槽内37℃的台式液中，连接BL-420E+生物机能实验系统，给予标本1.0 g基础负荷。约10 min后开始记录肌电，参数选择：扫描速度1.00 s/div，电增益2 mV，时间常数3 s，高频滤波10 Hz，连续记录30 min。

1.6 肠组织HE染色

在各测试时间点，取A组、B组小鼠各10只，C组15只，将小鼠麻醉完全后，打开肠腔，取回盲部以上2 cm处肠管，将其固定、脱水、包埋、HE染色，观察各组小鼠肠黏膜变化，并用Haglund肠黏膜评分表[8]评分。

1.7 统计学分析

所有的实验数据均采用SPSS 17.0统计软件分析，组间均数对比采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，使用Levene方法进行方差齐性检验，若方差齐，采用Student-Newman-Keuls法(S-N-K)进行组间比较。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 基本情况

A组和B组小鼠正常饮食，精神状况良好；C组小鼠精神倦怠，后肢完全瘫痪、反应迟钝、饮食量少。A组和B组小鼠无死亡，C组小鼠死亡5只，剖腹检查，3只小鼠肠胀气、色黄，甚至穿孔。

2.2 肠平滑肌肌电的变化

C组脊髓损伤后12 h回肠肌电频率和振幅明显低于A组(P<0.01)，并较B组降低(P<0.05)，呈较规则的正弦波样曲线(见图1中A1~C1)。C组脊髓损伤后24 h肌电频率和振幅也较A组和B组降低(P<0.05)(见图1中A2~C2)。脊髓损伤后48 h，C组肌电图出现少数切迹的非正弦波样曲线(见图1中A3~C3)，频率和振幅均较A组和B组减小(P<0.05)。见表1。

2.3 肠平滑肌收缩力的变化

脊髓损伤后12 h，C组回肠平滑肌收缩频率较A组和B组无显著性差异(P>0.05)，但振幅较A组和B组减少(P<0.05)，图像呈较规则的似正弦波形(见图2中A1~C1)。脊髓损伤后24 h，C组回肠平滑肌收缩力频率较A组增加(P<0.05)，振幅较A组和B组降低(P<0.05)(见图2中A2~C2)。脊髓损伤后48 h，C组平滑肌收缩频率较A组和B组升高(P<0.05)，振幅较A组和B组明显减少(P<0.01)，表现为有大量切迹的似正弦波样曲线(见图2中A3~C3)。见表2。

2.4 HE染色

对各组行HE染色，观察到各时间点，A组小鼠肠黏膜均无任何病理学改变(见图3)。B组小鼠肠黏膜有少量充血，但黏膜结构完整(见图3)。C组12 h亚组小鼠肠黏膜下层毛细血管充血，有少量炎性细胞浸润；24 h亚组小鼠绒毛少量脱落，黏膜下层毛细血管充血明显，炎性细胞浸润较多；48 h亚组小鼠肠绒毛有部分脱落，杯状细胞明显增生，黏膜下层有明显出血，炎性细胞浸润较多，肌层之间部分分离(见图3)。Haglund肠黏膜损伤评分显示，C组各个时间点损伤评分值均高于A组和B组(P<0.05)。见表3。

3 讨论

肠道功能障碍是临床上脊髓损伤后的常见并发症，患者常表现为便秘、结肠慢输、对非伤害性刺激低敏和自主神经紊乱[9-10]。治疗效果往往不佳，该类患者也是结直肠癌的高发人群[11]。众所周知，肠道功能主要由交感神经系统、副交感神经系统和肠神经系统等组成的神经细胞网络调控。人体生命活动正常时，来自脊髓的交感神经通过进入肠壁的交感神经后纤维和节前纤维，与部分肠神经节细胞形成突触联系，传递中枢神经系统的信息。脊髓损伤后，该系统传导中断，虽肠神经系统可自主调控肠道运动，但因交感神经冲动传导的缺失，肠道活动可出现调节紊乱[12]，使肠道内容物滞留，大大增加了肠腔内细菌量和细菌移位的发生概率。据报道，在脊髓损伤早期可出现肠道菌群移位和血清中的超氧化物歧化酶降低和丙二醛升高[6,13-14]，导致一系列神经源性肠道功能障碍。

肠肌电是一项反应肠道功能的电生理指标，可分为慢波电位和动作电位两种[15]。研究发现，不完全性肠梗阻小鼠肠道慢波频率减小、振幅降低[16]，慢传输型便秘大鼠结肠慢波双向改变，部分大鼠慢波频率减慢、振幅增加；而另一部分大鼠慢波与其相反[17]，提示慢波与肠道运动功能障碍密切相关。动作电位产生于慢波之上，但因其易受肽类物质、肠神经系统等多种因素的影响，所以我们只对肌电慢波活动进行测定[18]。结果显示，小鼠脊髓损伤后早期肠肌电节律紊乱，频率和振幅均明显低于正常组和假手术组，呈低频的类正弦波样曲线，有部分切迹。且时间点之间有明显差异，随病程发展，频率和振幅减小愈明显。提示脊髓损伤后早期，肠肌电活动可出现异常。

肠平滑肌收缩运动在一定条件下也能客观反映肠道功能。实验发现，肠缺血再灌注大鼠环形肌和纵形肌收缩力可分别受到不同程度的抑制，表现出收缩频率减慢和振幅降低[19]。而Uray等发现肠道高度水肿的大鼠，肌球蛋白轻链磷酸化水平降低，肠肌收缩力的下降[20]。本研究显示，脊髓损伤早期，回肠平滑肌收缩力频率呈双向改变，提示肠道便秘的初步形成，这与孙彦辉等[17]在慢传输型便秘大鼠上的研究结果一致，但收缩频率总体表现为升高，这可能与脊髓损伤早期小鼠肠道代偿性加快收缩有关，而收缩振幅却均较正常组和假手术组低。同时，本研究发现脊髓损伤后小鼠收缩力频率发展呈增高趋势，提示脊髓损伤后肠道功能障碍可能与肠道平滑肌的异常收缩有关，并可在损伤早期表现。

而HE染色发现，脊髓损伤后早期小鼠肠黏膜已出现损伤，绒毛脱落明显，炎性细胞浸润，杯状细胞增多，毛细血管充血甚至出血，肌层之间出现分离，各时间点肠黏膜评分均较正常组和假手术高。病理损伤程度呈渐进性发展，脊髓损伤后24 h和48 h小鼠肠黏膜损伤程度明显高于12 h时间点小鼠。损伤程度总体表现较轻，提示脊髓损伤早期可出现肠道黏膜损伤，但病变程度较轻。

综上所述，脊髓损伤后早期小鼠可表现出肠道肌电慢波活动的减少，收缩力的高频降低，并随病程发展，其异常愈加明显，并出现镜下可见的肠道黏膜损伤。表明肌电慢波和肠肌收缩力异常可能是脊髓损伤后肠道功能障碍的机制之一。本研究尚未对其他生物学效应进行验证，因此还需其他学者对脊髓损伤后肠道功能障碍的作用机制进行更加全面和深入的探讨。

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Intestinal Function Changes in Mice after Spinal Cord Injury in Early Stage

LIANG Yu,LI Can,LUO Lan,YANG Zheng,WANG Qiang,MA Jun,WANG Yang-yang,ZHANG Lu-lu,YANG Wei,YI Fang.Chengdu Medical College,Chengdu,Sichuan 610500,China

ObjectiveTo investigate the influence of spinal cord injury on intestinal function in mice after a short period.Methods105 Kunming mice were randomly assigned to normal group(group A,n=30),sham group(group B,n=30)and model group(group C,n=45).Group A

no treatment,group B was only exposed the spinal cord,while group C was induced by a constant compression with a modified arterial forcep at T10to establish spinal cord injury model.12 hours,24 hours and 48 hours after modeling,myoelectric slow wave activity and tension activity of the ileum were tested,and HE staining was used.ResultsCompared with groups A and B,the slow wave activity was significantly weaker in group C at every time point(P<0.05),so was the amplitude of tension activity(P<0.05).Frequency of tension activity was obviously higher in group C than in groups A and B 24 hours and 48 hours after modeling(P<0.05).The injury scores were higher in group C than in groups A and B(P<0.05).ConclusionThere is reduce in myoelectric slow wave activity,tension activity of the ileum and mild injury in intestinal mucosa in mice after spinal cord injury in the early stage.

spinal cord injury;intestine;dysfunction;mice

CITED AS:Liang Y,Li C,Luo L,et al.Intestinal function changes in mice after spinal cord injury in early stage[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(2):148-152.

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.02.006

1.国家级大学生创新创业训练计划项目(No.201313705002)；2.成都医学院大学生创新实验计划项目(No.CXXS201307)。

成都医学院，四川成都市610500。作者简介：梁羽(1993-)，女，四川绵竹市人，麻醉学本科生。通讯作者：杨拯(1980-)，男，汉族，四川苍溪县人，硕士，高级实验师，主要从事胃肠道动力障碍疾病和脊髓损伤的机制与治疗研究。E-mail:yzixjj@163.com。

R651.2

A

1006-9771(2015)02-0148-05

[本文著录格式]梁羽，李灿，罗兰，等.脊髓损伤后早期小鼠肠道功能的变化[J].中国康复理论与实践,2015,21(2):148-152.

2014-05-19

2014-06-09)

·临床研究·