激光针刀配合穴位注射威灵仙总皂苷对膝骨关节炎模型大鼠RF及PGE2的影响

颜 梅，郭俐宏

(十堰市太和医院湖北医药学院附属医院，湖北十堰442000)

激光针刀配合穴位注射威灵仙总皂苷对膝骨关节炎模型大鼠RF及PGE2的影响

颜 梅，郭俐宏△

(十堰市太和医院湖北医药学院附属医院，湖北十堰442000)

目的:观察激光针刀配合穴位注射威灵仙总皂苷对膝骨关节炎模型大鼠血清类风湿因子(RF)及前列腺素E2(PGE2)的影响，探讨其作用机制。方法:大鼠60只，随机分为空白对照组、模型组、激光针刀组、穴位注射组及综合治疗组，除空白对照组外其它4组动物于左前侧膝关节腔内注射弗氏完全佐剂(0.1 ml)造模。在造模成功后，模型组腹腔注射生理盐水;激光针刀组取左前肢循经取穴为主穴激光针刀治疗，辅以电针刺激关元、足三里、脾俞、气海、阳陵泉、肾俞、肝俞等配穴20 min;穴位注射组于左前侧膝骨关节腔内每日穴位注射威灵仙总皂苷(50 mg/kg);综合治疗组治疗方法为穴位注射组加综合治疗组。以上各组均连续治疗14天。测定动物关节腔积液中透明质酸(HA)、白介素IL－6、前列腺素E2(PGE2)、血清类风湿因子(RF)IgM－RF、IgA－RF阳性率，病理检查关节软骨MMP－1细胞阳性表达率。结果:激光针刀配合穴位注射威灵仙总皂苷显著降低模型大鼠IL－6、PGE2、IgM－RF、IgA－RF及MMP－1等指标，升高HA，与本组治疗前、模型组、激光针刀组及穴位注射组比较(P＜0.05)，差异有统计学意义。结论:激光针刀配合穴位注射威灵仙总皂苷能有效治疗实验性大鼠膝骨关节炎，其作用机制可能为激光针刀松解膝关节粘连的炎症组织，电针刺激激发经气，威灵仙总皂苷降低IL－6及PGE2等炎性因子刺激，提高关节腔内HA含量，阻断类风湿因子与抗原IgM、IgA结合，降低IgM－RF、IgA－RF合成，减轻变态反应发生而起到协同治疗作用。

激光针刀;威灵仙总皂苷;膝骨关节炎;前列腺素E2;类风湿因子;穴位注射

威灵仙总皂苷(Total Saponins of Clematis)为毛莨科植物威灵仙(Clematis chinensis osbeck)的干燥根及根茎经化学淬取的灭菌注射液，内含威灵仙皂苷元、酚类、黄酮类、常春藤齐墩果酸，具有消炎抑菌、清热、利尿强心的作用［1］。《本草纲目》记载威灵仙“味微辛咸”，通经络、消痰涎、祛风湿、散癖积，药性辛散温通，通行十二经脉，既能祛风湿，又能通经止痹痛［2］。本实验采取激光针刀配合穴位注射威灵仙总皂苷治疗实验性大鼠膝骨关节炎，以期研究联合治疗的镇痛消炎作用机制，为临床提供安全可靠的综合治疗方案。

1 材料和方法

1.1 动物及分组

SD大鼠48只，体质量(200±50)g，雌雄兼用，实验动物由湖北医药学院实验动物中心提供，实验动物设施使用许可证:SYXK(鄂)2011－0031，实验动物生产许可证:SCXK(鄂)2011－0008。采用随机数字表编号后随机分为模型组、激光针刀组、穴位注射组及综合治疗组，每组12只。

1.2 仪器及药品

弗氏完全佐剂(上海实生细胞生物技术有限公司);SDZ－II型电子针疗仪(上海坤弘，型号:SDZII);威灵仙总皂苷，由湖北医药学院药学院药物制剂研究室提供，总皂苷含量在50%以上，用时以无菌纯化水配制成所需浓度的混悬液;生理盐水。

1.3 造模方法

参照相关文献［3］造模方法，备皮消毒:电动剃须刀剃掉大鼠左前侧膝关节部位及以下鼠毛，皮肤消毒后用1 ml注射器将0.1 ml弗氏完全佐剂注入左前膝关节腔内(1、3、7天各1次)，采用超疲劳易提前发生膝骨关节炎的临床发病特点，可每天强制大鼠动物活动30～60 min，7天后如出现以下与临床急性膝关节炎表现一致的症状时即可确定造模成功:①左前膝关节出现红、肿、热、痛，同时软组织肿胀或积液;②左前膝关节及其周围僵硬、活动受限;③左前膝关节病理切片镜检出现关节腔大量渗出液，软骨表面粗糙，滑膜增生、粘连、肥厚等膝关节炎临床病理学改变;④实验室左前膝关节积液检查出现 IL－1β升高、HA含量降低。

1.4 治疗方法

将大鼠固定于大鼠固定器，激光针刀组取痛点循经取穴为主穴激光针刀治疗，辅以电针刺激关元、气海、足三里、阳陵泉、肾俞、脾俞、肝俞等20 min，治疗时以痛点穴位正极，配穴为负极，接SDZ－Ⅱ型电子针疗仪，连续波，频率10 Hz，留针20 min。穴位注射组于膝骨关节处穴位注射威灵仙总皂苷。综合治疗组先同激光针刀组治疗方法，在激光针刀治疗及留针20 min并休息60 min后，于左前膝骨关节穴位注射威灵仙总皂苷(50 mg/kg)。模型组每日注射生理盐水1 ml作为对照。以上4组动物治疗每日1次，7天为1个疗程，治疗2个疗程。

1.5 检验指标及方法

参照文献［4］，于治疗前后分别抽取大鼠左前膝关节腔积液，测定动物关节积液中透明质酸(HA)、白介素IL－6、前列腺素 E2(PGE2)、血清类风湿因子(rheumatoid factor，RF)IgM－RF、IgA－RF阳性率，并病理检查关节软骨MMP－1细胞阳性表达率(阳性细胞数/细胞总数×100%)。

1.6 膝关节肿胀百分率的测定

采用玻璃容器排水法测量治疗前后左前膝骨关节容积，计算左前膝关节肿胀百分率。方法为:先取50 ml量筒，先注入蒸馏水使液面与量筒最高处平齐，用20 ml注射器吸出10 ml蒸馏水。测量时用记号笔在大鼠左前膝关节缝矢状面做一标记，然后把大鼠左前肢缓慢伸入量筒内，使标记与量筒最高处平齐。移开动物后用已吸入20 ml蒸馏水的注射器向量筒内缓慢注入蒸馏水并使液面再次与最高处平齐，左前膝关节容积=20 ml－注射器内剩余蒸馏水体，反复3次取平均值。左前膝关节肿胀百分率(%)=(造模后容积－造模前容积)/造模前容积×100%。

1.7 数据统计

2 结果

2.1 IgA－RF、IgM－RF比较

见表1。模型组IgA－RF、IgM－RF保持在较高水平，说明变态反应严重，造模成功。激光针刀组治疗前后无变化，穴位注射组IgA－RF、IgM－RF明显下降，与激光针刀组及本组治疗前比较P＜0.05，综合治疗组降低程度较穴位注射组下降更明显，与本组治疗前、模型组、激光针刀组及穴位注射组比较P＜0.05，差异有统计学意义。

表1 各组大鼠IgM－RF、IgA－RF比较 (±s，n=12)

表1 各组大鼠IgM－RF、IgA－RF比较 (±s，n=12)

注:与治疗前比较，△P＜0.05;与模型组比较，▲P＜0.05;与激光针刀组比较，#P＜0.05;与穴位注射组比较，*P＜0.05。

组别IgM－RF(%)IgA RF(%)治疗前 治疗后 治疗前 治疗后模型组 74.24±7.66 77.57±7.24 66.83±7.19 69.23±6.21激光针刀组 73.21±7.53 70.01±7.15 68.12±7.07 65.89±6.50穴位注射组 71.34±7.61 37.57±3.12△▲ 66.32±7.09 44.23±4.22△▲综合治疗组 72.97±7.52 22.01±2.41△▲#*65.14±7.2132.89±3.54△▲#*

2.2 HA、IL－6比较

见表2。激光针刀组HA有一定的升高、IL－6有降低趋势，但与模型组及本组治疗前比较P＞0.05，差异无统计学意义。穴位注射组HA升高、IL－6降低，与激光针刀组及本组治疗前比较P＜0.05，差异有统计学意义。综合治疗组较激光针刀组及穴位注射组HA明显升高、IL－1β明显降低，与本组治疗前、模型组、激光针刀组及穴位注射组比较P＜0.05，差异有统计学意义。

表2 各组大鼠HA、IL－6比较 (±s，n=12)

表2 各组大鼠HA、IL－6比较 (±s，n=12)

注:与治疗前比较，△P＜0.05;与模型组比较，▲P＜0.05;与激光针刀组比较，#P＜0.05;与穴位注射组比较，*P＜0.05。

组别HA(μg/L)IL－6(pg/ml)治疗前 治疗后 治疗前 治疗后模型组1.48±0.22 1.77±0.29 32.28±3.30 30.57±3.11激光针刀组 1.46±0.23 1.69±0.25 30.21±3.51 27.31±2.87穴位注射组 1.44±0.20 0.94±0.08△▲#31.49±3.28 21.34±2.40△▲#综合治疗组 1.47±0.21 0.56±0.04△▲#*33.02±3.1912.30±1.05△▲#*

2.3 MMP－1、PGE2比较

见表3。模型组PGE2及MMP－1均保持在较高水平，与本组治疗前比较P＜0.05，差异有统计学意义。激光针刀组PGE2及MMP－1均有一定程度降低，与模型组及本组治疗前比较P＜0.05，差异显著。穴位注射组较激光针刀组降低明显(P＜0.05)。综合治疗组PGE2及MMP－1降低程度较大，与本组治疗前、模型组、激光针刀组及穴位注射组比较P＜0.05，差异有统计学意义。

表3 各组大鼠MMP－1、PGE2比较 (±s，n=12)

表3 各组大鼠MMP－1、PGE2比较 (±s，n=12)

注:与治疗前比较，△P＜0.05;与模型组比较，▲P＜0.05;与激光针刀组比较，#P＜0.05;与穴位注射组比较，*P＜0.05。

组别PGE2(OD)MMP－1(%)治疗前 治疗后 治疗前 治疗后模型组1.11±0.23 1.10±0.12 19.39±2.05 18.91±2.31激光针刀组 1.07±0.19 0.99±0.10 18.41±2.23 17.34±2.02穴位注射组 1.09±0.12 0.59±0.09△# 20.97±2.12 11.30±1.37△#综合治疗组 1.10±0.10 0.35±0.07△▲#*19.01±2.10 8.42±1.02△▲#*

2.4 各组动物足肿胀度、消肿时间比较

见表4。激光针刀组足肿胀度、消肿时间均有一定的降低，与模型组及本组治疗前比较P＜0.05，差异有统计学意义。穴位注射组与激光针刀组类似，两组间比较，P＞0.05。综合治疗组则明显优于激光针刀组及穴位注射组，与本组治疗前、模型组、激光针刀组及穴位注射组比较P＜0.05，差异有统计学意义。

表4 各组大鼠足肿胀度、消肿时间比较 (±s，n=12)

表4 各组大鼠足肿胀度、消肿时间比较 (±s，n=12)

注:与治疗前比较，△P＜0.05;与模型组比较，▲P＜0.05;与激光针刀组比较，#P＜0.05;与穴位注射组比较，*P＜0.05。

组别 足肿胀度(%)消肿时间(d)治疗前 治疗后 治疗前 治疗后模型组 35.92±3.70 39.21±4.01 13.20±2.35 13.50±1.57激光针刀组 34.41±3.29 26.34±1.41△▲ 13.21±2.51 10.33±1.12△▲穴位注射组 36.29±3.52 24.39±1.33△▲ 12.41±2.20 9.02±1.08△▲综合治疗组 32.29±3.53 10.31±1.21△▲#*13.49±2.13 6.34±0.92△▲#*

3 讨论

中医学认为，膝骨关节炎是由于膝关节局部湿浊痹阻及血瘀气滞而起，归“骨痹”“筋痹”范畴，治则当利湿除痹、舒筋通络、活血化瘀、行气止痛［5］。当膝关节滑膜受到劳损、外伤、感染等刺激后，滑膜下层毛细血管扩张，毛细血管通透性增大，致使关节内产生大量渗出液，出现关节积液［6］。此类患者常挟湿气下注于关节，肾气亏损、筋脉不通、经络瘀阻所致［7］。威灵仙为毛莨科植物威灵仙干燥根及根茎，《本草纲目》记载威灵仙“威言其性猛也，灵仙言其功效”、“味微辛咸”，能通十二经脉、消痰涎、祛风湿、散癖积［8］。其主要有效成分为常春藤皂苷元及齐墩果酸，具有清热、消炎抑菌、强心、利尿作用［9］。

膝骨关节炎常出现关节积液，其病理改变以炎性浸润关节腔及滑膜并造成关节面软骨被破坏、变性为主，关节软骨细胞类风湿因子及IL－6、PGE2等炎性因子侵蚀分解，关节腔内HA合成代谢紊乱而造成的慢性、退行性关节病变［10］。中医认为，当膝关节因外伤或其他原因受损伤后，局部关节血瘀气滞，湿浊之气痹阻于膝，治则当针灸以舒筋通络、行气止痛，中药内服外敷以活血化瘀、利湿除痹而达到临床治愈的目的［11］。

PGE2是机体的主要炎症因子，当出现感染时，PGE2大量产生。正常的关节滑液中仅含有微量IL－6，但当罹患膝关节骨性关节炎时，IL－6含量则会异常增高。关节液中HA是由N－乙酰氨基葡萄糖胺二糖及D－葡萄糖醛酸组成，是关节软骨基质及滑液的重要组成部分。HA可减少膝关节炎关节内PGE2等炎性介质的合成及扩散，减少滑膜的通透性及关节内渗液［12］。90%类风湿性关节炎患者病理及实验室检查ESR、IgM－RF、IgA－RF阳性率有不同程度的增高，BMPs下降的现象［13］。正常关节软骨中MMP－1细胞阳性表达极低，在膝骨关节炎早期常出现关节滑液IL－1β、PGE2及MMP－1细胞阳性表达率升高、HA降低的现象。

实验中取痛点循经取穴为主穴激光针刀治疗，可起到镇痛消炎的作用，辅以电针刺激关元、气海、足三里、阳陵泉、肾俞、脾俞、肝俞等20 min，是因为阳陵泉可强筋祛湿，主治膝痹;足三里具有养血益气之功效，主治下肢痿痹;而血海穴主活血，与阳陵泉及足三里配伍具有舒筋活络、利通关节之奇效［14］。实验数据显示，综合治疗组大鼠治疗后MMP－1细胞阳性表达率、PGE2、消肿时间、足肿胀度呈不同程度降低，这可能与电针刺激关元、气海、足三里、阳陵泉、肾俞、脾俞、肝俞等穴位激发经气，促进局部血液循环、增强病变组织新陈代谢、降低痛阈、减轻关节滑膜表面神经神经末梢对炎性因子IL－6、PGE2刺激有关［15］。结果与周效思等研究［16］威灵仙能明显延长小鼠热板痛阈时间和显著减少小鼠扭体反应的次数相吻合。综合治疗组大鼠在注射威灵仙注射液治疗后，HA较单用激光针刀及穴位注射增高更明显，IL－6、PGE2及MMP－1进一步下降，这应与威灵仙穴位注射促使滑膜内衬B型滑膜细胞和单核吞噬细胞大量分泌HA有关，达到润滑关节、延缓软骨退变及保护关节软骨的作用［17］。IgA－RF、ESR、IgM－RF下降可能与穴位注射威灵仙吸收后炎症因子的刺激及滑膜的通透性均降低有关，故病理检查MMP－1细胞阳性表达下降。同时，威灵仙总皂苷可能抑制了机体产生过多的IL－6及PGE2等炎症因子，降低滑膜的通透性及因炎症刺激而造成MMP－1细胞阳性表达，这对减轻IL－6及PGE2等对关节软骨细胞的破坏、减少关节腔内炎性渗出液及炎性反应起到至关重要的作用。

总之，通过激光针刀配合穴位注射威灵仙总皂苷联合治疗，可降低大鼠痛阈，促进大鼠关节腔血液及淋巴循环及炎症吸收，清除关节腔内IL－6、PGE2等炎性因子，抑制类风湿因子产生的变态反应，起到祛风除湿、活血化瘀、消肿镇痛作用，进而改善关节腔内环境而达“通则不痛”的功效。

［1］夏伦祝，徐先祥，张睿，等.威灵仙总皂苷对大鼠佐剂性关节炎抗炎作用的研究［J］.安徽医药，2009，13(4):363－365

［2］方文贤.医用中药药理学［M］.北京:人民卫生出版社，1998:343

［3］张晓轶，节晓光，张雅丽，等.“CHK”术式对大鼠膝OA中SOD、MDA及NO水平的影响［J］.贵州医药，2008，32(8):680－684

［4］陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京:人民卫生出版社，1994: 356

［5］张拴平，郝阳泉.关节内灌注冲洗并中药熏洗治疗膝骨性关节炎50例［J］.陕西中医学院学报，2010，33(5):68

［6］唐瑭，陈德森，李莉，等.通痹外敷膏联合关节腔冲洗治疗膝骨性关节炎合并积液的临床研究［J］.国际中医中药杂志，2014，3 (11):213－216

［7］Amin AR，dave M.COX－2，NO，and cartilage damageand repair［J］.CUR Rheumatol ReP，2000，2(6):447－453

［8］李增华.威灵仙考证探析［J］.中国现代医生，2007，45(20):62－63

［9］林凤平，任开明，宋恩峰，等.威灵仙对尿酸性肾病大鼠的实验研究［J］.中成药，2006，28(6):842－845

［10］国延军，牟成林，程杰，等.祛瘀通痹汤治疗原发性膝骨关节炎的临床研究［J］.河北中医药学报，2009，24(4):2l－22

［11］钟琴，刘正奇，安阳，等.苗药痛风停汤对急性痛风性关节炎模型日本大耳白大鼠血清IL－8的影响［J］.风湿病与关节炎，2014，21(1):16－18

［12］陈才兴，孙成长.中药内外兼治合透明质酸钠治疗膝关节骨性关节炎［J］.浙江中西医结合杂志，2006，16(7):427－428

［13］方海燕，姚兴琼.来氟米特联合益肾蠲痹丸治疗类风湿性关节炎的临床观察［J］.甘肃医药，2014，33(2):117－119

［14］谷国贞，秦同来.以灌洗为主综合治疗膝关节积液临床观察［J］.中医正骨，2004，16(7):33－34

［15］张蕴毅，张宏伟，李佩芬，等.威灵仙的解痉抗炎镇痛作用［J］.中成药，2009，23(11):808－811

［16］周效思，周凯.威灵仙水提取液的镇痛抗炎作用研究［J］.中国医药导报，2009，6(11):39－40

［17］张有新.威灵仙的功效与药理毒理研究［J］.包头医学，2012，36 (4):196－199

Effect of Total Saponins of Laser Knife Combined with Acupoint Injection of Radix Clematidis on RF and PGE2of Model Rats with Knee Osteoarthritis

YAN Mei，GUO Li－hong△
(Shiyan Taihe Hospital，Affiliated Hospital of Hubei Medical College，Shiyan442000，China)

Objective:Establishing the experimental operation for model rats with knee osteoarthritis，to observe the effect of laser needle knife combined with acupoint injection of Radix Clematidis saponins on serum rheumatoid factor(RF)RA and PGE2，and to investigate its mechanism of action.Methods:60 rats were randomly divided into a blank control group，a model group，a laser acupuncture group，an acupoint injection group and a combined treatment group，except the blank control group in other four groups animals

the left knee joint cavity injection of Freund＇s complete adjuvant(0.1 ml).After the success of modeling，the model group was injected with saline;laser needle knife group received electroacupuncture combined with laser needle knife treatment，electroacupuncturing at Guanyuan，Zusanli，Pishu，Qihai，Yanglingquan，Shenshu，Ganshu for 20 min;the acupoint injection group received the left knee joint cavity acupoint injection(50mg/kg);comprehensive treatment method was used for acupoint injection group and combined treatment group;each group was treated for 14 days.Determine animal articular effusion of hyaluronic acid(HA)and interleukin 6 IL－and prostaglandin E2(PGE2)，serum rheumatoid factor(rheumatoid，factor，RF)IgM－RF，IgA－RF positive rate，the positive expression rate of MMP－1 cells in pathological articular cartilage.Results:The laser knifecombined with acupoint injection of Radix Clematidis saponins could significantly decrease the IL－6，PGE2，IgM－RF，IgA－RF and could MMP－1 and increase HA.Compared with the model group，the laser needle knife group and acupoint injection group had a significant difference(P＜0.05).Conclusion:Laser knife combined with acupoint injection of Radix Clematidis saponins can be effective in the treatment of rats with knee osteoarthritis，and its mechanism may be related to the laser acupotomy knee joint adhesion in inflammation tissue，electroacupuncture stimulation，reduction of IL－6 and PGE2and other inflammatory factors stimulation，increase of HA content in articular cavity.Prevent rheumatoid factor from binding with antigen IgM and IgA，and decrease the combination of IgM－RF and IgA－RF，reduce the occurrence of allergic reactions and play a synergistic effect.

Laser needle knife;Total saponins of Radix Clematidis;Knee osteoarthritis;PGE2;Rheumatoid factors;Acupoint injection

R246.2

A

1005－0779(2015)12－0071－04

颜梅(1967－)，女，主管护师，主要从事临床中药药理及内分泌疾病护理工作。

△通讯作者:郭俐宏(1972－)，女，副主任护师，主要从事临床中药药理及康复护理工作。

2015－06－30