核桃多肽对D-半乳糖诱导老年小鼠血脂水平的影响

2015-01-30杨子明刘金磊颜小捷李典鹏

食品科学 2015年9期

杨子明，刘金磊，颜小捷，李典鹏*

（广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，广西植物功能物质研究与利用重点实验室，广西桂林 541006）

核桃（Juglans regia L.）原产于中亚，有胡桃、羌桃、合桃等别名，为“木本油料之王”，它与扁桃、开心果及榛子并列为世界四大干果[1-3]。核桃营养丰富，有补肾、温肺、润肠、强身健脑、驻颜延年功能，又称“万岁子”、“长寿果”、“益智果”、“美容果”，被历代医学家和养生学家视为益寿精品[4]。目前人们研究较多的是核桃油及核桃榨油后的核桃饼粕（富含核桃蛋白）的生物活性。有研究报道核桃油具有显著降血脂和降低动脉粥样硬化危险性的作用[5-7]，还具有抗氧化、抗衰老、提高记忆力、抗疲劳的作用[7-10]。樊永波等[11]发现核桃饼粕能明显提高大鼠学习和记忆能力，改善大鼠的抗氧化功能，提高乙酰胆碱酯酶的活性；核桃蛋白还具有抑菌、抑制血管紧张素转换酶以及抗肿瘤等生物活性[12]，但有关核桃蛋白及核桃多肽降血脂的研究尚未见报道，核桃多肽是核桃蛋白的酶解产物，其吸收率更好。蛋白质在动物体内以氨基酸或肽的形式被消化吸收[13]，近年来研究表明非单一氨基酸形式的小肽类具有重要的生理功能[14-17]。本实验利用植物蛋白水解专用酶一、植物蛋白水解专用酶二、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶这几种常用酶对核桃蛋白进行酶解，得到相应的核桃多肽，灌胃给予D-半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠，检测其对血脂水平的影响。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级BALB/c小鼠，体质量18～22 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。许可证号：SCXK（湘）2009-0004。

核桃饼粕青岛十相自在食品有限公司。

植物蛋白水解专用酶一（以下简称酶一）、植物蛋白水解专用酶二（以下简称酶二）南宁东恒华道生物科技有限责任公司；木瓜蛋白酶南宁庞博生物工程有限公司；碱性蛋白酶江苏锐阳生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒、总抗氧化能力（total antioxidative capacity，T-AOC）测定试剂盒南京建成生物工程研究所；总胆固醇（total cholesterol，TC）测定试剂盒、甘油三酯（triglyceride，TG）测定试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）四川迈克生物科技股份有限公司；低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）测定试剂盒长春汇力生物技术有限公司；D-半乳糖合肥Biosharp生物科技公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

LG-500A十两装型高速中药粉碎机浙江瑞安市百信药机器械厂；XS225A-SCS型电子天平瑞士Precisa公司；HH-S型水浴锅郑州长城科工贸有限公司；KQ 3200 DE型数控超声波清洗器昆山市仪器有限公司；CT-6023型pH计深圳市柯迪达电子有限公司；TGL-16R型高速冷冻离心机珠海黑马公司；RT-9100型半自动生化分析仪深圳雷杜生命科学股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃多肽的制备方法

核桃饼粕经粉碎过筛得到核桃粉，核桃粉经碱提酸沉得到核桃蛋白，核桃蛋白分别经酶一、酶二、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶的最佳酶解条件下酶解得到酶一核桃多肽（以下简称酶一组）、酶二核桃多肽（以下简称酶二组）、碱性核桃多肽（以下简称碱性组）、木瓜核桃多肽（以下简称木瓜组）。

1.3.2 老年小鼠模型的建立[18]

取BALB/c小鼠60 只，随机分成6 组：对照组、模型组、酶一组、酶二组、碱性组、木瓜组。除对照组小鼠注射生理盐水外，其余各组小鼠按1 500 mg/（kg•d）（以体质量计，下同）腹腔注射D-半乳糖，连续注射6 周。各给药组小鼠按生药量30 g/kg灌胃给药，对照组和模型组小鼠灌胃等量的蒸馏水，每天1次，连续6 周。

1.3.3 血脂水平及抗氧化能力的测定

第42天（实验末），小鼠禁食不禁水，称体质量，取血4℃条件下保存备用。处死小鼠后，取大脑，用冰冷的质量分数0.9%的生理盐水研磨制成匀浆液，离心取上清液，－20℃条件下保存备用。血脂水平及抗氧化能力指标的测定按试剂盒说明书方法进行操作。

1.4 数据处理及分析

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，实验数据均以±s表示，两个独立样本均数比较采用t检验，多个样本之间的两两比较采用单因素方差分析，P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 核桃多肽对小鼠体质量的影响

表1 核桃多肽对小鼠体质量的影响（±s，n＝10）Table1 Effect of walnut polypeptide on body weight in mice (±s,n= 10)

注：*.与对照组比较，差异显著（P＜0.05）；**.与对照组比较，差异极显著（P＜0.01）；#.与模型组比较，差异显著（P＜0.05）；##.与模型组比较，差异极显著（P＜0.01）。下同。

组别初体质量/g 末体质量/g对照组 21.41±1.46 25.28±2.07模型组 21.84±1.46 26.08±1.68酶一组 22.28±1.40 25.69±1.35酶二组 23.13±1.47 27.09±1.25碱性组 21.57±1.18 27.10±0.86木瓜组 21.40±1.29 26.60±1.05

由表1可知，连续给药第42天后，与对照组比较，模型组小鼠体质量没有发生显著变化（P＞0.05），说明D-半乳糖诱导的亚急性衰老模型并不会使小鼠体质量减轻，单从体质量这个指标不能反应小鼠的衰老状况，衰老指标需要从其他方面进行考虑；与模型组比较，核桃多肽各酶解组的小鼠体质量也没有发生显著变化（P＞0.05），说明核桃多肽对小鼠体质量没有影响。

2.2 核桃多肽对小鼠血脂水平的影响

表2 核桃多肽对小鼠血脂水平的影响（±s，n＝10）Table2 Effect of walnut polypeptide on blood lipids in mice (±s,n= 10)

TC含量/TG含量/HDL-C含量/LDL-C含量/组别（mmol/L）（mmol/L）（mmol/L）（mmol/L）对照组 1.94±0.30 1.73±0.33 1.17±0.08 1.38±0.16模型组 2.33±0.20* 2.05±0.29* 1.13±0.08 1.53±0.12*酶一组 1.88±0.22# 1.31±0.20## 1.23±0.09 1.36±0.17#酶二组 2.14±0.28 1.96±0.28 1.24±0.13 1.61±0.11碱性组 2.16±0.29 1.84±0.32 1.21±0.14 1.47±0.14木瓜组 2.22±0.22 1.77±0.45 1.38±0.12# 1.56±0.21

由表2可知，连续给药42 d后，与对照组比较，模型组小鼠TC、TG、LDL-C含量升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；HDL-C含量降低，但差异无统计学意义（P＞0.05），以上结果说明D-半乳糖诱导的亚急性衰老模型小鼠血脂水平会升高，这与人体女性血脂研究结果相同，而与男性相反。据研究报道，男性血脂水平主要表现为TC和TG水平均随着年龄的增加而降低，女性的TC和TG水平均随着年龄的增加而升高[19]。与模型组比较，酶一组可降低小鼠的TC、TG、LDL-C水平，且差异均具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，木瓜组能升高小鼠的HDL-C水平，差异具有统计学意义（P＜0.05）。酶二组、木瓜组、碱性组对小鼠的TC、TG、LDL-C水平均有一定的降低作用，但差异无统计学意义（P＞0.05）。由此可知，经植物蛋白水解专用酶一酶解的核桃多肽降脂效果最好，而其他几种水解酶效果不好。这其中的原因可能与核桃多肽的溶解性有关，实验中发现，经酶一酶解得到的核桃多肽溶解性最好，在灌胃给予小鼠后，吸收效果可能最好，因此其降脂效果也最好。

2.3 核桃多肽对小鼠血清抗氧化能力的影响

表3 核桃多肽对小鼠血清抗氧化能力的影响（±s，n＝10）Table3 Effect of walnut polypeptide on antioxidant capacity in serum of mice (±s,n= 10)

组别 SOD活力/（U/g） MDA含量/（nmol/g）对照组 140.44±15.66 7.80±0.64模型组 144.99±28.95 8.07±1.06酶一组 147.01±5.82 7.52±1.25酶二组 150.83±13.92 8.26±1.20碱性组 143.72±14.88 7.96±1.02木瓜组 160.35±14.27# 7.37±1.31

由表3可知，连续给药42 d后，与对照组比较，模型组小鼠的血清SOD活力和MDA含量没有发生显著变化，这与前人的研究结果不同。张艳玲等[20]发现给Wistar大鼠注射D-半乳糖5个月，会导致大鼠血清SOD活力和MDA含量显著下降；彭少君[21]发现给Wistar大鼠注射D-半乳糖6 周，也会导致血清SOD活力和MDA含量的显著下降；在小鼠方面，颜燕等[22]给昆明小鼠注射D-半乳糖8 周，导致小鼠血清SOD活力和MDA含量的显著下降；本研究的结果与前人不同，其原因可能是本研究所用的动物是BALB/c小鼠，与前人用的实验动物不一样，也可能是本实验周期只有6 周，时间太短所致。与模型组比较，木瓜组能升高小鼠血清SOD活性，具有统计学意义（P＜0.05）；其余各组对SOD活力和MDA含量均没有影响，说明核桃多肽对小鼠血清抗氧化能力的影响较小。

2.4 核桃多肽对小鼠大脑抗氧化能力的影响

表4 核桃多肽对小鼠大脑抗氧化能力的影响（±s，n＝10）Table4 Effect of walnut polypeptide on antioxidant capacity in brain of mice (±s,n= 10)

SOD活力/（U/g）组别 T-AOC活力/（U/g）MDA含量/（nmol/g）对照组 76.67±5.90 300.16±19.31 95.28±12.39模型组 65.33±4.64* 267.99±36.95* 115.32±20.06*酶一组 100.27±11.08## 331.41±55.56# 66.97±16.52##酶二组 96.60±4.31## 325.44±63.62# 103.45±21.81碱性组 86.53±3.47# 299.80±33.09# 112.10±20.71木瓜组 88.53±4.60# 324.66±9.57# 108.37±22.38

由表4可知，连续给药42 d后，与对照组比较，模型组小鼠大脑T-AOC、SOD活力下降，差异具有统计学意义（P＜0.05），MDA含量升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；这与前人的研究结果相同[20-22]。自由基理论在解释老年痴呆症中占有非常重要的地位，实验研究已经证实了自由基具有致衰老的作用，D-半乳糖诱导的衰老模型也得到了自由基学说的验证[23-24]。本研究也证实D-半乳糖会导致小鼠大脑自由基紊乱，大脑抗氧化能力减退。与模型组比较，核桃多肽各酶解组均能升高小鼠大脑T-AOC、SOD活性，差异具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）；与模型组比较，酶一组能降低小鼠大脑MDA含量，差异具有统计学意义（P＜0.01），其余各组也能降低MDA含量，但差异无统计学意义（P＞0.05）。以上结果说明核桃多肽各酶解组均能提高衰老小鼠大脑抗氧化能力，其中酶一组效果最好。有研究表明核桃饼粕（富含核桃蛋白）具有较好的抗氧化能力[11,25]，本研究证明核桃多肽具有较好的抗氧化能力，也证实了前人的研究结果。通过与前人研究结果对比，核桃多肽抗氧化能力强于核桃饼粕，其原因可能是核桃多肽的吸收率强于核桃蛋白，这也可能是酶一组抗氧化能力最强的原因。

3 结论

综上所述，核桃多肽具有降低D-半乳糖诱导老年小鼠血脂水平的作用，也可以提高其大脑抗氧化功能，说明核桃多肽具有较好的生物活性。核桃多肽相比于核桃蛋白，其溶解性更好、吸收性也更好，因此其降血脂、抗氧化功能也强于核桃蛋白。本实验结果表明，经植物蛋白水解专用酶一酶解的核桃多肽水溶性最好，其降脂、抗氧化功能也最强，说明经植物蛋白水解专用酶一酶解的核桃多肽在动物体内吸收最好，能够有效地发挥核桃蛋白的作用。

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