青蒿素的合成生物学研究进展

孔建强，王伟，程克棣，朱平

（中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所，天然药物活性物质与功能国家重点实验室，卫生部天然药物生物合成重点实验室，北京 100050）

青蒿素的合成生物学研究进展

孔建强，王伟，程克棣，朱平

（中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所，天然药物活性物质与功能国家重点实验室，卫生部天然药物生物合成重点实验室，北京 100050）

青蒿素是一种非常优良的抗疟药物，存在活性好、毒副作用小、市场需求大、来源窄等特点，从而导致价格昂贵，不利于疾病的治疗和预防，严重影响人类的健康安全。因此，需要建立一种大规模的、廉价生产这种药物的替代方法。现在看来，天然药物合成生物技术无疑是最理想的。天然药物合成生物学是在以基因组解析技术和化学合成技术为核心的现代生物技术基础上，将工程学和系统生物学相结合，综合分子生物学、生物信息学、药物化学、药物合成、药物分析、药理学等学科，建立起来的以规模化和程序化制备天然药物为目的的集成学科。从本质上说，天然药物合成生物学技术是一种采用绿色、可持续发展方式规模化制备天然药物的工程化生物合成技术，代表着未来天然药物制备的发展方向之一。其研究内容目前主要包括两个方面：一是天然药物固有代谢途径的解析、重构与工程化，即通过基因工程，将天然药物生物合成相关途径酶基因导入大肠杆菌、酿酒酵母以及模式植物细胞中，在这些底盘细胞中重构一条天然药物的生物合成途径，将这些细胞构建成能制备天然药物的“细胞工厂”，利用“细胞工厂”生长繁殖快的特点，源源不断的制备天然药物；二是全新天然药物合成途径的设计、筛选、组装与程序化，即根据天然药物的生源合成途径，从基因数据库中寻找相应的酶基因，并将这些酶基因转移到底盘细胞中，组装成一条全新的多基因控制的药物合成途径，利用这条代谢途径制备出结构优化、产量丰富的天然药物。经过十几年的发展，天然药物合成生物技术已被成功地应用到青蒿素的规模化制备中，并取得了一系列成果。

1 青蒿素生物合成及相关酶基因研究进展

青蒿素生物合成途径现在并不是完全清楚。根据相关中间体的分离和结构鉴定[1-8]，以及生物合成相关酶基因的克隆与功能鉴定[9-27]，再加上原位青蒿素饲喂实验[3,7,8,28,29]综合分析，推断青蒿素的生物合成主要包括四大步骤：第一步是通过甲羟戊酸途径和非甲羟戊酸两条途径形成法尼基焦磷酸（farnesylpyrophosphate，FPP）[30,31]；第二步是在紫穗槐-4,11-二烯合酶（amorpha-4,11-diene synthase，ADS）的作用下将 FPP环化形成青蒿素的中间体紫穗槐-4,11-二烯[19-21]；第三步是在紫穗槐-4,11-二烯氧化酶（amorpha-4,11-diene oxidase，AMO）的作用下，紫穗槐-4,11-二烯进一步被氧化形成青蒿醇、青蒿醛，进而合成青蒿酸和/或二氢青蒿酸[22,23,25]；第四步是青蒿酸和/或二氢青蒿酸通过一系列酶反应和/或非酶反应形成青蒿素（图 1）[28,29,32,33]。在这条合成途径中，第四步争议最大。早期的研究表明，青蒿酸是青蒿素最直接的前体[32,33]；而随着青蒿素分子生物学的发展，二氢青蒿酸是青蒿素最直接的前体又逐渐被研究人员提出[3,7,8,29]。究竟谁是青蒿素最直接前体，现在尚无定论。推测青蒿中可能存在至少两条青蒿素生物合成途径，即分别以青蒿酸和二氢青蒿酸为最直接前体的两条生物合成途径，不同青蒿中存在哪条合成途径取决于其化学型[34,35]。

参与青蒿素生物合成途径的酶基因中，参与FPP生物合成的酶基因绝大部分都已经通过克隆得到，如脱氧木酮糖-5-磷酸合酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，DXPS）[9,10]、脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶（1-deoxyxylulouse 5-phosphate reductoisomerase，DXPR）[9,11,12]、1-羟基-2-甲基-2-丁烯基-二磷酸合酶（1-hydroxy-2-methyl-2-butenyl diphosphatesynthase，HDS）[13]、1-羟基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-焦磷酸还原酶（hydroxy-2-methyl-2-（E）-butenyl 4-diphosphate reductase，HDR）[14]、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzymeA reductase，HMGR）[15]和法尼基焦磷酸合酶基因（farnesyl pyrophosphate synthase，FPPS）[16-18]等。而以FPP为底物特异合成青蒿素的酶基因也有部分被克隆并进行了功能鉴定。如紫穗槐-4,11-二烯合酶[19-21]、紫穗槐-4,11-二烯氧化酶[22-24]、细胞色素P450氧化还原酶（cytochrome P450 oxidoreductase，CPR）[22]、青蒿醛双键还原酶[25]和醛脱氢酶[26]等编码基因的克隆与功能鉴定。在上述酶基因中，参与萜类共同前体FPP生物合成的酶基因保守性较强，性质稳定，较多的见于各种实验论文和综述中，本文不作详细介绍。紫穗槐-4,11-二烯合酶是青蒿素生物合成的第一个特异性酶，其性质与基因克隆、功能鉴定参考笔者以前的综述[27]。下面对其余参与青蒿素合成的特异性酶基因作简单介绍。

1.1 紫穗槐-4,11-二烯氧化酶基因

在青蒿或非青蒿植物中，存在着多个能氧化紫穗槐-4,11-二烯的酶[22-24,36]。2005年，Bertea等[3]以青蒿叶片微粒体酶对紫穗槐-4,11-二烯进行催化实验，结果在产物中检测到了青蒿醇的存在。根据这个结果，以及青蒿醇和紫穗槐-4,11-二烯相似的结构特点，Bertea等推断在青蒿中存在一个P450羟基化酶，这个酶能将紫穗槐-4,11-二烯催化生成青蒿醇。

2006年，美国的 Keasling[22]和加拿大的 Covello[23]两个实验室先后从青蒿腺毛中克隆得到了紫穗槐-4,11-二烯氧化酶基因CYP71AV1，并进行了功能鉴定，但对于CYP71AV1编码框的大小，这两个实验室的结果有所不同。Keasling实验室推断CYP71AV1长为1485 bp，编码494氨基酸的蛋白，而Covello实验室推断CYP71AV1长为1464 bp，编码487氨基酸的蛋白，通过对两个实验室提供的具体序列进行分析，发现Keasling实验室多出的碱基位于CYP71AV1的5' 末端。尽管在氨基酸序列上存在差异，但这两个实验室对这两个蛋白都进行了功能鉴定，发现这两个蛋白都能将紫穗槐-4,11-二烯连续催化形成青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸，是多功能酶。随后几年，CYP71AV1基因被不同实验室的科研人员从不同的青蒿株系中克隆得到[37,38]，目前，在GenBank中注册的CYP71AV1基因已有十几条。CYP71AV1的编码序列和现在已知的其他P450之间的一致性很低，最高51%，表明该P450是一种菊科植物特异的P450氧化酶，考虑到青蒿素是青蒿中的特异成分，有理由推测CYP71AV1参与了青蒿素的生物合成途径。进一步的功能鉴定证实了这个结论。CYP71AV1对底物具有特异性，只能作用于紫穗槐-4,11-二烯，而对其他单萜和倍半萜如柠檬烯（limonene）、α-蒎烯（α-pinene）、β-蒎烯（β-pinene）、松香芹醇（pinocarveol）、（-）-异长叶烯（-）-alloisolongifolene）、石竹烯（caryophyllene）、（-）-α-古芸烯（-）-α-gurjunene）、（+）- γ-古芸烯（+）-γ-gurjunene）、（+）-喇叭烯（+）-ledene）、（+）-β-芹子烯（+）-β-selinene）和（+）-朱栾倍半萜（+）-valencene）则没有活性。CYP71AV1的表达具有组织特异性，RT-PCR结果表明，CYP71AV1在腺毛中的表达水平最高，其次是花芽（flower bud），而在叶和根中的表达水平非常低，几乎检测不到RT-PCR产物[23]。

Teoh等[23]通过进一步的试验表明，CYP71AV1除了能作用于紫穗槐-4,11-二烯，连续形成青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸之外，还能作用于二氢青蒿醇，形成二氢青蒿醛，但对二氢青蒿醛几乎没有活性。

除了从青蒿中克隆青蒿素生物合成相关基因之外，2010年，Nguyen等[24]从包括菊芋（Cichoriumintybus L.）在内的5种菊科植物中分离得到了5个大香叶烯A氧化酶（germacrene A oxidase）cDNA，功能鉴定表明，大香叶烯A氧化酶除了能连续氧化大香叶烯A形成对应的酸外，还能连续氧化紫穗槐-4,11-二烯形成青蒿酸，但当这些氧化酶和来自青蒿的电子配偶体CPR偶联进行氧化反应时，其对紫穗槐-4,11-二烯的氧化活性要低于 CYP71AV1。这是第一例从非青蒿植物中分离得到具有氧化紫穗槐-4,11-二烯活性的氧化酶的报道。

2011年，Cankar等[36]从菊芋根中除了克隆得到上面介绍的大香叶烯A氧化酶cDNA外，还克隆得到一个P450氧化酶CYP71AV8基因，该基因CDS长为1491 bp，编码496氨基酸，和CYP71AV1（DQ315671）的氨基酸一致性为78%，与大香叶烯A氧化酶（GU256644）的氨基酸一致性为81%。该酶除了催化（+）-valencene 生成（+）-nootkatone之外，还能分别催化大香叶烯A和紫穗槐-4,11-二烯生成germacra-1（10），4,11（13）-trien-12-oic acid和青蒿酸，与CYP71AV1不同的是，将紫穗槐-4,11-二烯投入该酶的反应体系中时，在反应产物中除了检测到了青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸之外，还检测到了二氢青蒿醛。多个具有紫穗槐-4,11-二烯氧化功能的P450酶的出现丰富了合成生物学制备青蒿素前体的可能性，同时，通过对这些酶进行进化分析，可能衍生得到具有超强紫穗槐-4,11-二烯氧化功能的P450酶。

1.2 细胞色素P450还原酶基因

CYP71AV1是一种 P450氧化酶，其不能单独发挥作用，必须由电子配偶体的配合。2006年，Keasling实验室在克隆得到CYP71AV1后，从青蒿中将CYP71AV1的电子配偶体——细胞色素P450还原酶基因也克隆了出来[22]。

1.3 青蒿醛双键还原酶

2008年，Zhang等[25]通过综合运用蛋白部分纯化、质谱和EST文库的方法从青蒿中克隆得到一个青蒿醛Δ11（13）双键还原酶基因，命名为Dbr2。Dbr2基因长为1245 bp，编码414氨基酸的蛋白质，分子质量为45.6 kD。Dbr2蛋白和植物的12-氧代植二烯酸还原酶（12-oxophytodienoate reductases）蛋白家族具有最高的氨基酸一致性。Dbr2 的180、183和185位含有3个高度保守的组氨酸。Dbr2的最适pH是7.5，当pH为5.5时，Dbr2的活性被抑制，当pH为9.0 时，Dbr2的活性只有20%。Dbr2在腺毛中表达最高，特异性地作用于青蒿醛，生成11R-二氢青蒿醛，对青蒿酸、青蒿醇、artemisitene 和arteannuin B均无活性。

2009年，Zhang等[39]从青蒿中分离得到一个双键还原酶，命名为Dbr1，这个蛋白长为346氨基酸，分子质量为38.5 kD，基因编码长度为1041 bp。Dbr1含有一个富含甘氨酸的的多肽序列——AASGAVG，这个结构参与了结合NAD（P）H 和NAD（P）中的焦磷酸基团。底物结合位点处含有1个保守性很高的Tyr，在Dbr1中含有1个保守的催化结构域SQY。在Dbr1的C末端有1个保守结构域GKNVGKQVVXVAXE，但其功能尚不清楚，Dbr1最适pH是7.0，用NADH做辅助因子时，没有活性。Dbr1和Dbr2一样，也能催化青蒿醛形成二氢青蒿醛，但产物以11S-二氢青蒿醛为主，此外，在待检测的底物中，Dbr1和Dbr2共同的底物只有青蒿醛和2E-nonenal。

1.4 醛脱氢酶

2009年，Teoh等[26]从青蒿中分离得到1个醛脱氢酶基因，命名为Aldh1。该基因CDS长为1497 bp，编码498氨基酸，分子质量是53.8 kD。ALDH1的N末端无信号肽，也没有细胞器定位序列。ALDH1含有两个非常保守的结构域，一个是含有谷氨酸活性位点的保守结构域，另一个是含有半胱氨酸活性位点的保守结构域。这两个保守结构域参与了ALDH1的催化功能。此外，ALDH1还含有保守的4个氨基酸，分别是Gly243、Gly297、Glu397 和Phe399，这4个氨基酸参与了与辅因子的结合。ALDH1在腺毛中表达最高，在花芽中表达适中，在叶子中表达较低，而在根中检测不到活性，这种表达方式与CYP71AV1的很相似，也与青蒿素在植物中的分布很相似，表明ALDH1可能参与了青蒿素的生物合成。ALDH1 能作用于青蒿醛和二氢青蒿醛，生成相应的青蒿酸和二氢青蒿酸。此外，该酶对短链的烷基醛（alkyl aldehye）也有弱的活性。以二氢青蒿醛为底物时，其最适pH是8.5，用NAD和NADP作辅因子时都有活性。

2 青蒿素合成生物学研究特点

青蒿素的合成生物学研究是伴随其生物合成途径的逐步阐明而发展起来的。由于从青蒿酸/二氢青蒿酸形成青蒿素的途径不是很清楚，现在通过合成生物学技术制备青蒿素的研究绝大部分采用的都是一种半合成的路线。即通过代谢工程制备青蒿素的前体如紫穗槐-4,11-二烯[40，41]、青蒿酸[42，43]和二氢青蒿酸[25]，然后通过半合成的方法合成青蒿素[40-43]。经过若干年的发展，青蒿素合成生物学的研究取得了重要进展，呈现如下几个特点。

2.1 底盘细胞种类多样

与普通异源宿主不同的是，用于合成生物学研究的底盘细胞是一种遗传背景清楚、按照工程化原理构建的标准化集成细胞，可以为模块工作提供稳定场所，并能用于工业化生产。迄今为止，用于青蒿素及其中间体合成生物学研究的底盘细胞有大肠杆菌（Escherichia coli）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、植物细胞和其他微生物（表1）。

E.coli是所有工程菌中开发最早、最成熟的一种。尽管缺少糖基化和翻译后加工等功能，但大肠杆菌具有遗传背景清楚、生长快速、生长周期短、安全性好、可以进行高密度培养、适合表达不同基因产物和成本低及易于操作等优点，因此成为青蒿素合成生物学研究中首选的宿主菌，已经在大肠杆菌中重构了紫穗槐-4,11-二烯[40,44-55]和青蒿酸[52]等青蒿素中间体的合成途径。

酿酒酵母是一种真核生物，因其具有内膜系统，更适合包括P450氧化酶等基因在内的植物次生代谢酶基因的表达，因此，在青蒿素合成生物学研究中，被更多的作为紫穗槐-4,11-二烯[22,41,55-63]、青蒿酸[22,25,36,37,41-43,64-65]和二氢青蒿酸[25]等重要中间体人工制备系统的宿主细胞。

和微生物相比，植物表达系统有自己的优势，如具有精细的调控系统，能通过光合作用获得代谢前体物质等。利用植物表达系统制备的萜类化合物产量一直很低，提高幅度较慢，但植物表达系统是获得代谢产物种类最多的底盘细胞。已经获得了紫穗槐-4,11-二烯[21,66-70]、青蒿醇[68]、二氢青蒿醇[68]、青蒿酸糖苷[69]和青蒿素[70]等代谢产物。

除了上述几种比较常见的底盘细胞外，构巢曲霉也被用来制备紫穗槐-4,11-二烯[71]。

2.2 青蒿素合成生物学研究实现了多种产物的制备

在青蒿素的合成生物学研究中，已经可以通过烟草制备出抗疟药物青蒿素[70]，尽管产量较低，但这个开创性的报道具有非常重要的意义。首先表明通过异源宿主细胞可以获得青蒿素，其次，加深对青蒿素生物合成途径的了解，从而促进青蒿素合成生物学的进一步发展。除此之外，通过合成生物学研究还制备获得了不同的青蒿素中间体，如紫穗槐-4,11-二烯[21,22,40,41,44-63,66-70]、青蒿醇[68]、二氢青蒿醇[68]、青蒿酸[22,36,37,41,52,64-65]、青蒿酸糖苷[69]和二氢青蒿酸[25]。并且以这些中间体为合成前体，进行了广泛的半合成青蒿素的研究，取得了重要的进展。有些半合成青蒿素的产量已经无限接近工业化的水平[40-43]。

2.3 重构青蒿素及其中间体代谢途径的方式多样

目前主要通过两种模式在不同的底盘细胞中构建青蒿素及其中间体代谢途径。第一种模式是青蒿素及其中间体固有代谢途径的转移、重构与工程化，这种模式是建立在青蒿素代谢途径的深刻解析的基础之上，是青蒿素合成生物学研究中主要的模式。这种模式的主要特点是重构的青蒿素及其中间体的代谢途径与原植物中的代谢途径基本保持一致。通过这种模式构建的青蒿素及其中间体工程化生物系统中，一种方式是只导入了青蒿素生物合成特异途径中的基因，利用底盘细胞中固有的底物供应途径，便可达到制备青蒿素中间体的目的（图2）。这种构建方式主要是基于基因工程的原理设计的。和别的重构方式相比，这种方式相对较为简单。这种青蒿素及其中间体工程系统的构建理念被广泛地运用到了不同的底盘细胞中，更主要的目的是想验证不同代谢途径在底盘细胞中重构的可能性[19-21,50,55,56,63,67,68]。

第二种方式也是利用底盘细胞中固有的底物供应途径，和第一种方式不同的是除了导入青蒿素生物合成特异基因之外，还导入了底物供应途径的限速酶基因，通过增加这些限速酶基因的拷贝数，提高目的产物的产量（图3）。和第一种方式相比，通过这种方式构建工程菌时，在基因工程的原理上引入了模块化设计的理念。这样构建的工程菌中，一般含有两个模块，即青蒿素及其中间体合成模块与萜类前体调控模块。组成这两个模块的基因一般分处在不同的质粒上[44-47,51,52,54,62]，但考虑到底盘细胞的代谢负担，这两个模块的基因有时候也克隆在同一载体上[47,70]。自然界主要存在两条萜类前体供应的途径，根据萜类前体调控模块将这种方式的工程菌分为两大类，即含DXP途径调控模块的工程菌和含MVA途径调控模块的工程菌。Martin等[44]构建了一种紫穗槐-4,11-二烯E.coli工程菌，除了导入ADS基因之外，还导入了含DXP途径的3个限速酶基因的模块，导致目的产物紫穗槐-4,11-二烯产量提高了3.6倍。2006年，Ro等[22]构建了以酿酒酵母为底盘细胞的青蒿酸工程菌，在该工程菌中，除了导入了含青蒿酸生物合成特异基因的模块之外，还导入了含MVA途径基因的调控模块，通过调控模块的作用，使工程菌中青蒿酸的产量大幅提升，达到115 mg·L-1。除此之外，还有很多实验室构建的工程菌都采用了这种青蒿素及其中间体合成模块与MVA 途径调控模块共转化的模式，如Kong等[37,62]、Wu等[50]、van Herpen等[69]以及Farhi等[70]等构建的工程菌。

第三种方式是另外导入一条底物供应途径，这样既可以在不需要底盘细胞供应底物的情况下，完成青蒿素及其中间体的制备，也可以同时利用底盘细胞固有的底物供应途径和引入的底物供应途径提供的底物制备青蒿素及其中间体。和前两种方式相比，这种方式通过模块化的设计导入更多的基因，给底盘细胞带来的代谢负担最重，因此，在操作上更为繁杂。这种构建工程菌的方式融入了工程化思想，使得重构的代谢途径成为一条可拆卸的即插即用的“电路”（图 4）。2003年，美国伯克利分校的 Keasling课题组构建了一个能制备紫穗槐-4,11-二烯的E.coli工程菌，在这个工程菌中，导入了3个模块，即甲羟戊酸合成模块（顶部模块，top module）、FPP合成模块（bottom module）和紫穗槐-4,11-二烯合成模块[44]。这3个模块都由一些可拆卸的即插即用的元件构成，因此，既可以方便地对模块中的元件进行优化[54]，也能便捷地将这些模块用于其他代谢途径的构建[52]，将众多复杂的生物合成途径演变成了可随时拆卸用的工程化生物系统。此后的很多学者也采用了类似的方法构建了不同的青蒿素及其中间体工程化系统[52]。

在底盘细胞中构建青蒿素及其中间体代谢途径的第二种模式是全新青蒿素及其中间体合成途径的设计、筛选、组装与程序化。这种模式是根据青蒿素及其中间体的化学结构设计的一条合成路线。根据这条合成路线从基因数据库中筛选出能参与设计好的合成路线的酶基因，并将这些酶基因导入底盘细胞中，在底盘细胞中组装成一条新的青蒿素及其中间体的合成路线。这样构建的青蒿素及其中间体的合成路线和原植物中的合成路线明显不同，它是建立在深厚的化学和生物功底的基础之上，不需要详细了解青蒿素在原植物中的合成路线。Dietrich等[65]构建了一个能制备artemisinic-11S，12-epoxide的大肠杆菌工程菌，在这个工程菌中，除了导入能合成紫穗槐-4,11-二烯的操纵子之外，还导入了一个突变的长链脱氢酶基因 P450BM3，这样构建的代谢途径并不是青蒿中存在的，然而，利用这样构建的工程菌产生的artemisinic-11S，12-epoxide 为底物，通过半合成的方法却能制备得到青蒿素的直接前体二氢青蒿酸。

3 提高工程菌中目的产物产量的措施

3.1 通过“开源”方式增加前体供应

青蒿素是一种倍半萜，其生物合成包括两部分（图1）。上游部分（top pathway）主要指倍半萜共同前体FPP的形成。通过MEP和MVA两条途径形成的FPP池可以为下游各种倍半萜以及甾体提供前体物质。下游部分（bottom pathway）是青蒿素生物合成的特异途径，即在ADS的竞争作用下，将上游途径中形成的FPP池中的部分FPP引入青蒿素生物合成代谢流中。因此，为了提高工程菌中青蒿素或其中间体的产量，就必须将更多的前体FPP导入青蒿素生物合成的特异途径中。总体来看，现在实现这一目的的方式主要采用“开源”和“节流”两种。所谓“开源”，是指提高工程菌的FPP池中底物的总量，从而提高进入青蒿素生物合成途径的底物的绝对总量，这是提高工程菌产量的主要方式，包括提高FPP形成途径中各个途径酶的效率，如增加基因拷贝数、对启动子进行修饰、密码子优化、基因替换、调控辅酶数量以及选择不同区室等；或者通过优化或平衡多基因控制的代谢途径实现底物供应的增量。而“节流”则是限制或减少底物流向别的代谢流，促使相对更多的FPP进入青蒿素生物合成特异途径。在青蒿素工程菌优化过程中，这两种方式既可以单独应用，也可以联合应用。

3.1.1 增加基因的拷贝数

增加FPP合成途径中酶基因的拷贝数，能有效地增加底物的供应，这个观点已经为很多实验所证明。为了提高DXP途径合成FPP的效率，Martin等[44]在工程菌中导入了含DXP途径关键酶基因的质粒，通过增加这些限速酶的基因拷贝数，使得构建的工程菌产生的紫穗槐-4,11-二烯产量高于对照。为了增加重构青蒿酸代谢途径中底物FPP的供应，Ro等[22]在酿酒酵母工程细胞中增加了MVA途径的限速酶基因HMGR和FPPS的拷贝数，使得青蒿酸的产量显著上升。Pitera等[46]通过采用将途径酶基因克隆到多拷贝的表达质粒上的方式，增加途径酶基因的拷贝数，从而有效地增加了工程菌中底物的供应。孔建强等[62]的实验也表明，增加甲羟戊酸途径中的HMGR和FPPS编码基因的拷贝数，能有效地提高紫穗槐-4,11-二烯的产量。这种方法操作性很强，而且效果很直接，因此很多实验室都采用了增加基因拷贝数的策略来提高重构生物系统中底物的供应，进而提高工程菌中目的产物产量[46,50,66,70]。

除了通过增加途径酶基因的拷贝数来提高酶催化的效率之外，通过调控因子间接地促进这些途径酶基因的表达效率也是青蒿素合成生物学中比较常用的一种方法。UPC2是一种转录因子，能调控甾体生物合成途径中的许多酶基因表达，也包括FPP 生物合成途径中的部分酶基因。因此，过表达upc2，能有效地增加FPP生物合成途径中的许多酶基因的转录，进一步提高他们的表达效率，增加FPP的供应，有效地改善工程菌中紫穗槐-4,11-二烯和青蒿酸的产量[22]。

3.1.2 启动子修饰

启动子的强弱能有效地影响基因表达的效率。Pitera等[46]通过将甲羟戊酸生物合成相关操纵子的Lac 启动子替换成强启动子araBAD后，导致甲羟戊酸积累。Anthony等[47]的实验也证明，采用强启动子时，甲羟戊酸生物合成相关操纵子的表达确实加强，导致紫穗槐-4,11-二烯产量显著提高。Redding-Johanson等[51]的实验进一步表明，使用强启动子能增加甲羟戊酸激酶和磷酸甲羟戊酸激酶的表达活性，进而提高工程菌中紫穗槐-4,11-二烯的产量。相对于上述采用强启动子调控部分途径酶基因的转录相比，Westfall等[41]对整条代谢途径的途径酶基因都采用强启动子进行过表达，结果发现，这样的效果更佳，和前者相比，整条代谢途径都过表达的工程菌产生的青蒿酸产量提高了2倍，而紫穗槐-4,11-二烯的产量更提高了5倍。

除了通过强启动子调控途经酶基因的效率之外，将含启动子的不同基因的表达盒转录方向置于相反的方向，可以有效地避免因为启动子序列相同而导致的基因重组，保证其调控的基因能有效地转录[41]。

3.1.3 密码子优化通过优化

FPP形成途径中的途径酶的密码子，显著增加其表达，增加底物供应，也是一种方法。Anthony等[47]将FPP生物合成途径中的途径酶基因进行优化，由此构建的工程菌中紫穗槐-4,11-二烯的产量提高明显。Redding-Johanson等[51]也证实了通过优化甲羟戊酸激酶和磷酸甲羟戊酸激酶编码基因而使这两个基因在工程菌中的表达活性上升，导致了紫穗槐-4,11-二烯产量的提升。然而，不是所有途径酶基因优化都能得到预期的效果。Anthony等[47]发现，当甲羟戊酸生物合成相关操纵子以及甲羟戊酸激酶被优化后，都会引起产物上升，而对MBIS 操纵子进行密码子优化，效果不是很明显。

3.1.4 基因替换

青蒿素是通过萜类途径提供前体，而萜类生物合成途径广泛地存在于各种生物中，因此，不同生物中存在各种不同的萜类生物合成相关的酶基因，不同生物中的同工酶作用也有强弱之分，为了增加重构的代谢途径中的酶的催化效率，使用活性更强的同工酶替换原来代谢途径中的酶也是提高蛋白表达丰度，增强其催化效率，进而提高底物供应的一种方法。由于代谢途径中积累过多的HMG-CoA会导致细胞生长，不利于目的产物的制备，为了将更多的HMG-CoA引入青蒿素生物合成特异途径，2011年Ma等[54]对该工程菌中甲羟戊酸合成模块中的HMGR基因元件进行功能替代分析时，发现当用来自Delftia acidovorans的HMGR基因元件替代原代谢途径中的HMGR元件后，引起HMG-CoA含量上升，从而提高AD产量。Tsuruta等[40]进一步对该工程菌进行研究表明，当用来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的HMGR和HMGS两个基因元件取代工程菌中甲羟戊酸代谢模块中的HMGR和HMGS元件后，该工程菌中紫穗槐-4,11-二烯产量也会显著上升。

3.1.5 增加辅酶数量

萜类生物合成途径中有许多酶发挥作用都需要辅酶的参与，增加这些辅酶的数量也能显著提高途径酶的催化效率。Ma等[54]的实验表明，通过增加HMGR辅酶NADH的数量，能显著提高HMGR的催化效率，促使更多的HMG-CoA生物合成AD。

3.1.6 选择不同的区室

这种策略主要针对以植物为底盘细胞的合成生物学研究。植物中存在两条萜类生物合成途径，细胞质中主要是 MVA途径发挥作用，而质体主要通过MEP途径供应前体，在这两条途径的作用下，在不同的区室形成了含量有差异的萜类前体池。当将不同的萜类生物合成途径导向不同的区室时，由于前体供应的差异，使得萜类产物的产量也有很大不同。Wu等[66]通过研究表明，导向质体的紫穗槐-4,11-二烯代谢途径产生的紫穗槐-4,11-二烯产量比导向细胞质中的紫穗槐-4,11-二烯代谢途径产生的紫穗槐-4,11-二烯产量高40000倍，达到了25 μg·g-1鲜重。随后，Zhang等[68]的实验也支持了这个结论。Farhi等[70]的实验进一步表明，导向线粒体的青蒿素代谢途径产生的青蒿素和紫穗槐-4,11-二烯产量比导向细胞质中的青蒿素代谢途径产生的青蒿素和紫穗槐-4,11-二烯产量都要高，而且增加的幅度很大。上述实验结果表明，选择合适的区室对于达成通过合成生物学规模化制备青蒿素及其中间体的目的具有很重要的意义。

3.1.7 优化或平衡多基因控制的代谢途径

提高途径酶基因的表达，确实能改善其催化效率，然而对于多基因控制的整条代谢途径而言，局部的改善产生的效果并不理想。局部的改善往往导致代谢中间产物的积累，进而使细胞产生负担，导致毒性，抑制其生长，不利于代谢目的产物的获得。Keasling课题组在对2003年构建的大肠杆菌工程菌进行优化时发现，过表达甲羟戊酸生物合成模块，会导致HMG-CoA积累，从而抑制细胞生长，反而不利于目的产物的产生。而增加HMG-CoA还原酶的拷贝数，消耗过多的HMG-CoA能恢复细胞的生长，这种现象说明平衡异源代谢流对于提高工程菌中目的产物的产量至关重要[46]。Pfleger等[53]构建一种基于基因间隔区（intergenic regions）文库的筛选方法，实现对操纵子多个基因协同调控，解决异源代谢途径的平衡问题。综上所述，通过代谢流控制分析[48,49]，实现代谢途径平衡运行，进而有效地高产制备目的产物是青蒿素合成生物学的终极目标之一。

3.2 通过“节流”方式增加前体供应

除了增加FPP的绝对供应总量之外，减少FPP池中的前体流入其他倍半萜代谢途径，促使相对更多的前体流入青蒿素及其中间体生物合成的特异途径也是有效提高其产量的方法。这些节流措施主要包括抑制或下调竞争代谢途径，从而限制或减少流入竞争代谢途径中的FPP供应。如为了提高进入青蒿酸生物合成途径的FPP的流量，Ro等[22]和Paradise等[58]都通过下调竞争性甾体合成途径中的ERG9基因的表达，减少进入甾体生物合成途径中的FPP代谢流，从而相对增加进入青蒿酸生物合成途径的FPP流量，进而增加目的产物紫穗槐-4,11-二烯和青蒿酸的产量。Lenihan等[42]的实验也证明，下调ERG9基因的表达，确实能增加代谢产物青蒿酸的产量。

3.3 提高底物利用效率

提高了底物的供应量，并不一定能显著提高工程化底盘细胞中目的产物的产量。要想使底物数量的变化在产物产量上有所体现，关键还是取决于重构的代谢途径对底物的利用效率。在青蒿素代谢途径中，底物利用主要通过青蒿素生物合成特异途径来完成。因此，工程化底盘细胞能否获得高产的目的代谢产物，取决于青蒿素生物合成特异途径的效率。提高青蒿素生物合成特异途径中的途径酶效率，主要通过两种方式，即提高单个基因效率和优化平衡整条途径来实现这个目的。对于单个基因效率的提高，主要采取增加基因拷贝数、密码子优化、强启动子调控和融合基因等方式。对于代谢途径的平衡优化，主要采用一种基于全局的数学算法和生物信息分析，如代谢流控制分析。相对于单个基因效率的提高，整条代谢途径的平衡优化显得更为困难和复杂，对最终产物产量的影响也是最深刻和直接的。

3.3.1 增加基因拷贝数

增加代谢途径中目的基因拷贝数，通过过表达该基因能有效地增加产物的产量。Lindahl等[57]和Kong等[56,63]都证明，增加酿酒酵母工程菌中ADS基因的拷贝数，能提高紫穗槐-4,11-二烯的产量。Anthony等[47]的实验也表明，减少工程菌中ADS基因的拷贝数，紫穗槐-4,11-二烯的产量也会因此而显著降低。

3.3.2 密码子优化

采用宿主偏爱的密码子，减少或避免使用稀有密码子是提高途径酶基因异源表达水平的重要手段。为了增加紫穗槐-4,11-二烯合酶基因在大肠杆菌中的表达，Martin等[44]将ADS基因突变成用大肠杆菌偏爱密码子表示的序列，并将其导入大肠杆菌，对获得的工程菌进行发酵表明，ADS的表达显著增强，产生的紫穗槐-4,11-二烯产量明显提高。

Kong等[61]通过连续重叠PCR的方法，获得了完全用酿酒酵母偏爱密码子表示的ADS基因，含有该基因的酵母工程菌产生的紫穗槐-4,11-二烯产量比对照提高了10～20倍。该结果再次表明，优化途径酶基因的密码子是有效改善其表达水平的途径之一。然而，如果将参与青蒿酸生物合成的3个基因ADS、CYP71AV1和CPR都采用酿酒酵母偏爱密码子表示的序列，这样构建的工程菌产生的青蒿酸产量没有显著变化，上述结果说明，多个基因优化并不是多个单一基因优化的简单总和，详细的机制目前并不清楚[41]。

3.3.3 启动子修饰

除了使用强启动子调控途径酶基因的表达外，为了减少异源多基因控制的代谢途径在底盘细胞中发生基因重组而导致基因沉默的情况发生，将构成同一代谢途径的不同基因通过不同的启动子进行调控能有效地规避这个不利现象的发生。Farhi等[70]利用不同的启动子和终止子对青蒿素生物合成途径酶基因进行调控，在烟草细胞中有效地合成出了青蒿素。

3.3.4 基因替换

Chang等[52]的实验表明，当CYP71AV1的N 末端跨膜序列被假丝酵母（Candida tropicalis）的P450跨膜序列取代时，或者CYP的N末端跨膜序列被假丝酵母的CPR跨膜序列取代时，工程菌中代谢产物出现了差异。

3.3.5 增加基因之间的偶联效率

在青蒿素生物合成途径中，P450氧化酶CYP71AV1及其电子配偶体CPR的偶联对代谢途径的影响比较显著。Zhang等[68]在N.tabacum中导入了青蒿素生物合成相关的基因：FPPS、ADS、CYP71AV1和Dbr2，结果表明，转基因烟草中积累青蒿醇和二氢青蒿醇，并没有检测到预计的青蒿酸和二氢青蒿酸的生成。据此推断，烟草的内环境更适于醛的还原，而且植物内生的乙醇脱氢酶活性要强于CYP71AV1的青蒿醇和青蒿醛氧化酶活性，从而促使CYP71AV1氧化形成的青蒿醛还原成青蒿醇，或者将Dbr2催化形成的二氢青蒿醛还原成二氢青蒿醇。另外Farhi等[70]也利用了N.tabacum进行了合成青蒿素及其中间体的尝试，他们在N.tabacum中除了导入上述4个基因之外，还导入HMGR和CPR两个基因，结果表明，通过这种方式构建的转基因烟草中制备出了青蒿素。在这种植物工程系统中，HMGR的导入主要是增加前体的供应，而导致产物出现差异的一个重要原因是CPR基因的导入。CPR的导入增加了和CYP71AV1的偶联效率，提高了它的氧化效率，有利于氧化产物的产生，进而形成青蒿素。这个结论在Chang等[52]的实验中也得到了佐证。Chang等在利用E.coli 制备青蒿酸的实验中发现，CYP71AV1和CPR的偶联效率要强于CYP71AV1与异源CPR的偶联效率，导入了CYP71AV1和CPR的E.coli工程菌产生的青蒿醇产量提高了12倍。

3.3.6 质粒替换

质粒作为基因的载体被导入不同的工程化细胞，实现多基因控制通路的重构与优化。因此，质粒自身的性质对工程化细胞中目的产物的产量也会有显著的影响。Chang等[52]的实验表明，当将CYP71AV1克隆pETDUET-1中时，会导致CYP71AV1表达效率降低，从而影响CYP71AV1 的功能，发酵产物中只能检测到青蒿醇。而将CYP71AV1克隆到pCWori中时，CYP71AV1的氧化效率显著增加，直接表现就是青蒿醛和青蒿酸出现在发酵产物中。

此外，工程菌中质粒之间的兼容性对产物的产量也具有很大的影响[47]。

3.3.7 底盘细胞替换

作为天然产物的生产场所，底盘细胞性质的差异对目的产物也会造成非常大的影响，主要体现在产量和性质两个方面。除了在分类上属于不同界的底盘细胞，如植物、酿酒酵母和大肠杆菌产生的产物会出现差异之外，同一个种的底盘细胞，即便只是基因型出现差异，产生目的产物的能力也会显著不同。Chang等[52]的实验表明，和DH10B相比，采用DH1作为宿主菌，能显著增加紫穗槐-4,11-二烯的的氧化效率。

3.4 优化培养和生产条件

除了对青蒿素代谢途径自身进行优化外，培养条件对工程菌中青蒿素及其前体的产量也有相当大的影响。根据紫穗槐-4,11-二烯容易挥发的特点，Keasling实验室认为2003年的实验有可能低估了紫穗槐-4,11-二烯的产量[44]，因此，他们利用两相分配生物反应器（two-phase partitioning bioreactor，TPPB）来制备紫穗槐-4,11-二烯，结果表明，加入有机相后，紫穗槐-4,11-二烯的产量显著增加，达到0.48 g·L-1[45]。但这种两相分配生物器不是对所有青蒿素及其中间体工程菌的发酵都适用，Chang等[52]在发酵培养大肠杆菌工程菌生产青蒿酸时发现，去掉有机相覆盖层，会显著促进青蒿酸产量上升，这就表明任何一个外界条件都有一定的适用范围，条件优化应该根据对象进行设计。

考虑到二氢青蒿酸通过光氧化能自发地形成青蒿素，Farhi等[70]在培养导入了ADS、tHMGR、CYP71AV1、CPR和DBR2 5个基因的植物细胞生产系统时，采用强光培养的方式，结果表明，转基因烟草在强光条件下，确实能将由上述5个酶催化形成的二氢青蒿酸转化产生青蒿素。

除了上述培养条件，培养基的成分对工程菌发酵也会产生重大的影响。Martin等[44]发现，在培养基中添加甘油，会增加工程菌的生物量和紫穗槐-4,11-二烯的产量。Westfall等[41]证明，将乙醇和葡萄糖作为培养基的混合碳源时，发酵产生的紫穗槐-4,11-二烯产量显著增加。而将碳源变成半乳糖时，发酵产物中的青蒿酸产量上升明显[42]。此外，对工程菌进行分批补料发酵时，对氮源和碳源进行限制[40]，或者对葡萄糖和磷酸盐进行限制[41]，都能有效增加工程菌的生物量，提高目的产物的产量。

这些结果说明提高人工系统制备目的天然产物的能力，必须采用“内因”和“外因”协调优化的方式，即既要对代谢途径进行系统的优化，又必须有针对性的优化培养条件，只有这样，才能以最优的方式将工程菌中目标代谢物的产量提高到工业化的水平。

从上面可以看到，经过十多年的发展，通过底盘细胞生产青蒿素及其中间体无论从理论上还是物质上都已经准备充分。网络上早就有赛诺菲-安万特公司开始利用工程酵母制备青蒿素的报道，意味着合成生物学制备的青蒿素正式走向生产。

4 小结

通过合成生物学制备青蒿素及其中间体的成功，无论对青蒿素本身还是对未来天然药物的生产格局都会产生深远的影响。通过合成生物学制备青蒿素，不受环境和土地的制约，能在短时间内获得大量的青蒿素，能稳定世界市场上青蒿素的供应，有效地降低青蒿素的价格，有利于控制疟疾在贫困国家的肆虐。青蒿素是医药界的“重磅炸弹”，通过合成生物学制备青蒿素的成功，其意义可能不止每年几十亿元的销售额。首先，它对其他稀缺药物的绿色制备具有借鉴意义，能有效地推动天然药物的可持续发展、能引领其他天然药物的绿色制备，更重要的是通过合成生物学制备青蒿素的成功经验和技术能移植到其他化工产品、能源和材料的合成生物学研究中，能有效地缓解由于人口剧增带来的土地供应问题以及由于化学合成及土地施肥造成的环境污染问题，对于建设“绿色中国”和“绿色世界”的目标都具有非常重要的意义。

摘编自《药学学报》2013年2期：193～205页，图、表、参考文献已省略。