正交设计联用星点设计-效应面法优化蒿甲醚长循环纳米结构脂质载体处方

孙艺丹，赵青，王锐利，梁桂贤，张淑秋

（山西医科大学药学院，太原 030001）

正交设计联用星点设计-效应面法优化蒿甲醚长循环纳米结构脂质载体处方

孙艺丹，赵青，王锐利，梁桂贤，张淑秋

（山西医科大学药学院，太原 030001）

蒿甲醚（artemether，ARM）是一种倍半萜内酯类的化合物（化学结构式见图1），主要用于抗氯喹恶性疟及重症疟疾的治疗[1]。纳米结构脂质载体（nanostructured lipid carriers，NLC）是由液态脂质及固体脂质组成的新型纳米给药系统[2]。研究表明，普通纳米粒注射给药后，易被网状内皮系统的单核巨噬细胞（mononuclear phagocytic system，MPS）吞噬。用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）对纳米粒的表面进行修饰可以增加其亲水性，并形成空间位阻避免被MPS识别[3-5]。正交设计和星点设计-效应面优化法是常常被采用的实验设计方法。其中正交实验设计所建立的指标和因素之间关系的数学模型是一种线性模型，精度不够、预测性较差。星点设计-效应面优化法是一种多元非线性拟合的实验设计方法，但需考察的因素较多时，则实验次数偏高。因此，在进行处方优化时，首先用正交实验设计进行多因素的初步筛选，再将所确定的主要影响因素采用星点设计进行优化，旨在达到利用较少的试验次数得到具有较高预测精度的数学模型的目的[6]。本文作者拟将ARM 制备成聚乙二醇-硬脂酸酯（PEGSA）修饰的NLC，采用正交-星点设计效应面法优化处方。

1 仪器与材料

Agilent1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司），TDL-5-A 低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂），FA1104电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司），85-2恒温磁力搅拌器（金坛荣华仪器制造有限公司），APV2000高压匀质机（北京同和友德科技有限公司），Zetasizer ZS90激光粒度分析仪（英国马尔文公司），JEM-1011透射电镜（日本电子公司）。

蒿甲醚（含量质量分数100.4%，重庆华方武陵山制药有限公司，批号C00320130502），聚氧乙烯氢化蓖麻油（北京偶合科技有限公司），单硬脂酸甘油酯（天津光复精细化工研究所），中链甘油酸三酯（上海运宏化工制剂辅料有限公司），聚乙二醇-硬脂酸酯（PEG-SA，北京百灵威科技有限公司，聚合度为40）。

2 方法与结果

2.1 蒿甲醚长循环纳米结构脂质载体的制备

称取处方量的单硬脂酸甘油酯、中链脂肪酸脂及聚氧乙烯氢化蓖麻油，于（73±3）℃水浴加热作为油相；待油相混匀后，加入处方量的ARM，搅拌使其溶解。另称取处方量的PEG-SA，加入上述油相中，搅拌均匀作为混合油相。将处方量的纯化水加热到相同温度后，注入混合油相中，搅拌均匀即得初乳。冷却至室温，用高压匀质机（8×107 Pa）匀化5次，迅速冷却至室温，得呈蓝色乳光的ARM-NLC。

2.2 包封率的测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水-冰醋酸（V︰V︰V =85.4︰13.6︰1.0）；流速：

1.0 mL·min-1；检测波长：230 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL[7]。

2.2.2 标准曲线的制备和精密度试验

精密称取ARM50 mg，置于50 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，作为ARM储备液。精密量取ARM储备液适量，用流动相稀释成质量浓度为0.1、0.3、0.5、0.7和0.9 g·L-1的系列标准溶液，进样测定。结果表明，样品的质量浓度（ρ）在0.1～0.9 g·L-1内与峰面积（A）有良好的线性关系，回归方程为A= 198.3ρ + 0.4000（R2=0.9999）。分别取质量浓度为0.1、0.5 和0.9 g·L-1的ARM溶液进行精密度试验，每个质量浓度样品连续进样测定3次，RSD 分别为1.95%、0.99%和0.63%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 超滤离心法测定包封率的加样回收率试验

分别精密量取质量浓度为1.0 g·L-1蒿甲醚储备液适量，置于10 mL量瓶中，用空白NLC稀释成质量浓度为0.25、0.5 和0.8 g·L-1的蒿甲醚混悬液。分别精密吸取上述溶液0.4 mL置于超滤管（截留分子质量3 ku，超滤管体积0.4 mL）的上室，3500 r·min-1离心45 min。取离心后的上室及下室溶液适量，用流动相稀释适当倍数后，按“2.2.1”条色谱条件测定药物含量，每个质量浓度样品平行测量3次，计算游离药物的回收率。由表1可知，游离药物在下室的回收率在98.64%～100.21% 内，上室未检测到药物，说明游离药物可自由通过超滤膜。空白纳米粒在波长209 nm处有最大吸收，测量离心后下室溶液在波长209 nm处的吸光度为0。综上所述，游离药物可自由通过超滤膜，而纳米粒不能通过超滤膜，借助离心力的作用可以将游离药物与纳米粒分离。

2.2.4 包封率的测定

精密量取ARM-NLC 0.4 mL置于超滤管（3 ku，0.4 mL）的上室，3500 r·min-1离心45 min。取适量离心后的上室溶液用流动相溶解并稀释适当倍数后，用HPLC法测定包封于NLC中ARM的质量。另取ARM-NLC 1 mL，置于10 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，用HPLC法测定NLC中ARM的总质量。包封率（entrapment efficiency，wEE）的计算公式为wEE=m1/m2×100%。其中，m1为包封于NLC中的ARM的质量，m2为NLC中ARM的总质量。

2.3 粒径及zeta电位的测定

将待测样品用纯化水稀释100倍后使用ZS90激光粒度仪测定其粒径及zeta电位，测定温度为25℃。

2.4 处方优化

2.4.1 实验设计

依据预实验结果，按L18（37）安排试验，初步考察固液脂质质量比（X1）、脂质含量质量分数（X2）、脂质与乳化剂质量比（X3）、PEG占脂质的质量分数（X4）、药物占脂质的质量分数（X5）、PEG的聚合度（X6）6种影响因素3水平。以包封率为指标，对数据进行直观分析，确定主要影响因素。正交试验设计及直观分析结果见表2。

采用正交设计助手v3.1软件，对结果进行直观分析，确定3个主要影响因素为固液脂质质量比（X1）、PEG占脂质的质量分数（X4）、药物占脂质的质量分数（X5）。综合考虑各因素，次要因素进一步确定为脂质含量质量分数3%，脂质与乳化剂质量比为2.5，PEG的聚合度为40。

依据正交实验设计筛选结果，按三种主要影响因素五水平星点设计安排实验，进一步考察影响处方配比的主要影响因素X1、X4、X5对包封率（Y1）、粒径（Y2）、zeta电位（Y3）及总评“归一化”值（overall desirability，OD，Y4）的影响。因素及水平结果见表3，星点实验设计安排及结果见表4，根据“2.4.2”条的处理方法求算OD值。

2.4.2 OD值的计算

根据试验的目的，确定各指标可接受的最大值和最小值，结果见表 5。各指标可接受范围的选择依据：疟原虫可诱导宿主红细胞的细胞膜产生新渗透性通道（new permeability pathways，NPPs）以满足自身摄取营养物质的需要。有文献报道，粒径小于80 nm的粒子可以通过此通道进入疟原虫体内[8]，并且为了保证NLC的形态良好，故将ARM-NLC的粒径范围限定在25～80 nm内。Zeta电位可以用于预测NLC的稳定性，具有较高的zeta电位的NLC由于电荷的相互排斥，粒子不易聚集。一般来说，稳定的NLC其zeta电位的绝对值应在30 mV左右[9]，故将zeta电位的绝对值限定在25～40 mV 内。总评“归一值”（overall desirability，OD）为各指标的综合结果，故应选取较大值的范围在0.5～1.0内。

根据各指标可接受的范围将各指标归一化为0～1.0间的归一值（desirability，di），将各指标的di根据公式：OD=1/n求算[10]，得总评“归一值”。OD值的计算过程中，各指标的权重均为1。其中，对于取值越大越好的指标（如包封率）和取值越小越好的指标（如：粒径、zeta电位）分别按公式：dimax= (Yi–Ymin）/(Ymax–Ymin）和dimin=( Ymax–Yi）/( Ymax–Ymin）计算各指标的di[11]。

2.4.3 回归方程的拟合

采用Design Expert 8.0.6软件，分别以Y1、Y2、Y3和Y4为因变量，X1、X4和X5为自变量进行拟合，多元线性回归结果：Y1= 90.54﹣2.32X1﹣2.38X4﹣3.28X5（R = 0.466 7，P>0.05）；Y2=32.1﹣3.97X1﹣2.80X4+ 0.72X5（R = 0.6465，P<0.05）；Y3=﹣28.39 + 1.12X1+ 1.14X4﹣0.84X5（R = 0.395 3，P>0.05）；Y4= 0.41﹣6.8 ×10﹣2 X1﹣5.1 × 10﹣2 X4+ 8.712 × 10﹣3 X5（R =0.327 8，P>0.05）。多元非线性回归结果：Y1=86.68 + 3.14X1﹣3.12X4+ 2.10X5+ 5.5X52+9.62X12X4﹣2.94X13﹣1.76X53（R =0.9657，P<0.0001）；Y2= 28.81﹣3.97X1﹣2.8X4+ 0.72X5+ 1.32X1X4+1.21X1X5+ 0.68X4X5+ 2.20X12+ 1.23X42+ 1.27X52（R = 0.7630，P>0.05）；Y3=﹣28.85 + 1.56X1+0.64X4﹣0.55X5﹣2.01X1X4﹣2.59X1X5﹣2.71X4X5+ 0.89X12﹣0.21X42﹣2.3 × 10﹣2 X52﹣2.74X1X4X5+ 0.88X12X4﹣0.51X12X5﹣0.77X1X42（R =0.9635，P<0.05）；Y4= 0.45﹣0.14 X1﹣6.1 × 10﹣2X4+8.660 ×10﹣3X5+0.11X1X4+0.15X1X5+8.9 ×10﹣2X4X5﹣7.0 × 10﹣2 X12﹣8.81 × 10﹣3 X42+ 2.8 ×10﹣2X52+ 0.19X1X4X5+ 1.7 × 10﹣2 X12X4+ 8.975 ×10﹣5X12X5+0.13X1X22（R = 0.9628，P<0.05）。由拟合方程的回归系数R及P值可知，除粒径外，采用非线性回归方程能更好地拟合其余3个指标。且方程通过F检验，可用于ARM-NLC处方的优化预测。对于粒径指标，仍采用多元线性方程进行处方的预测。

2.4.4 效应面优化及预测

根据OD值的多元非线性回归方程，采用Design Expert 8.0.6软件，固定三个影响因素中的一个为中值，绘制其余两个因素对OD值的三维效应图，结果见图2。

根据图2和拟合方程，选取粒径在30 nm左右，包封率较高，zeta电位较低，综合指标即OD值较高的区域。采用Design Expert 8.0.6软件，根据上述限定条件，软件自动筛选计算得优化处方为X1= 1.8，X4= 21.3%，X5= 24.6%。

2.4.5 验证试验

按优化处方制备3批ARM-NLC，其平均粒径、包封率和zeta电位结果见表6。从表6可知，实验值与模型预测值偏差的绝对值小于10%，说明模型可以较为准确地描述因素与指标的关系。

2.5 形态观察、zeta电位及粒径分布

取适量ARM-NLC滴在铜网上，以质量分数2.0%磷钨酸染色10 min后，于透射电镜下观察形态。由图3可见，纳米粒大小均匀，形态圆整。取适量ARM-NLC，用纯化水稀释100倍后，用ZS90激光粒度仪分别测定其粒径分布及zeta电位，结果见图4，粒径为29.2 nm，PDI为0.163，zeta电位为-37.2 mV。

3 讨论

a.PEG是水溶性、无生物活性、无毒的线性高分子，为了使其能稳定地与NLC相连，需要引入脂溶性且与NLC有很好匹配性的化合物。目前多采用先合成聚乙二醇的脂类衍生物，然后用聚乙二醇衍生物作为NLC 组分之一，制备PEG修饰的NLC。为保证PEG分子结构的伸展以获得对NLC表面的最大屏蔽效果，合成的聚乙二醇衍生物最好只在其一端连有脂溶性片段。本实验选用PEG 与硬脂酸酯化的衍生物作为修饰剂，其既含有亲水性的PEG又含有疏水的硬脂酸。当PEG-SA与NLC混合在一起，其疏水端插入NLC脂性核中，PEG端向外，从而形成稳定的PEG的保护层。

b.对处方进行优化时，常需考察多个指标，而根据每个指标得到的优化范围可能会不一致。故可采用“归一化”法对各个指标进行综合来反映因素对效应的影响。本文作者以各指标的总评“归一值”为指标，建立的方程具有良好的预测能力。

c.包封率测定的方法确证阶段，通过加样回收率考察未包封药物的透膜能力。加样回收率试验中用空白NLC制备ARM的混悬液，分别测定离心后的上室与下室溶液中蒿甲醚的含量。结果显示，上室未检测到药物，下室游离药物的回收率在 98.64%～100.21% 内，说明游离药物可以自由通过超滤膜。测量离心后下室溶液在空白纳米粒最大吸收波长处的吸光度为 0，说明离心力不能使空白纳米粒透过超滤膜。综上所述，借助离心力的作用，可以将未包封药物与空白纳米粒分离。由于离心后未包封药物大部分位于超滤管的下室，又因本文采用的药物含量测定方法的检测限偏高，故测定不到上室极微量的药物。

摘编自《沈阳药科大学学报》2015年1期：7～13页，图、表、参考文献已省略。