M3受体对胆管癌细胞增殖凋亡的影响

路健，冯玉杰，陈宗凯，张炳远

胆管癌起源于胆管上皮细胞，是一种破坏力极强的恶性肿瘤，它具有低诊断率和高病死率的特点[1]。发病隐匿、缺乏理想早期诊断标记物、对常规放化疗缺乏敏感性，这些都是造成胆管癌患者预后极差的症结所在。手术是目前唯一有效的根治方法。近年来研究发现神经浸润是胆管癌一种常见的生物学特性，且与术后复发率和预后密切相关[2]。毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3在肿瘤发生发展中起到重要的作用[3]。本试验主要通过Western blotting检测胆管癌细胞中M3受体的表达，并以CCK-8与流式细胞术观察其激动剂及抑制剂对胆管癌细胞增殖凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 标本来源

胆管癌RBE细胞系（上海细胞库）。

1.2 主要试剂、耗材及药物的配制

毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3人多克隆抗体（北京中山生物技术有限公司），RPIM1640培养基（Hyclone，美国），胎牛血清（Hyclone，美国），Cell Counting Kit-8（CCK-8）（Beyotime，中国），匹罗卡品粉剂（SIGMA），硫酸阿托品（武汉昌恒生物医药制品研究所）。匹罗卡品先配成30 mmol/L的浓度，滤器过滤除菌，纯1640培养液稀释使用。硫酸阿托品使用时也用纯1640培养液稀释使用。

1.3 细胞株的培养及传代

取对数生长期的细胞用0.25%胰蛋白酶消化后备用。每天倒置显微镜观察细胞生长情况，定期拍照记录。

1.4 Western blotting检测RBE细胞中M3受体蛋白的表达

用不同浓度匹罗卡品及硫酸阿托品处理细胞72 h后，用PBS洗3～4次；细胞裂解液冰上裂解30 min。超声粉碎，13000 r/min离心10 min留含全蛋白的上清液，用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。取各处理组等量蛋白样品进行不连续十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电转移至硝酸纤维素膜；5%脱脂奶粉在室温下封闭2 h；加入单抗，孵育12 h，洗膜；加入合适浓度HRP二抗，孵育2 h，用增强化学发光剂（ECL）化学发光法检测，于Mias图象分析系统中分析，蛋白含量以Volume值表示（Volume：OD×mm2）。

1.5 CCK-8法检测M3受体激动剂及阻滞剂对RBE细胞增殖的影响

取对数生长期细胞，以每孔5000个细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔体积100μL，置于37 ℃、5% CO2、95%空气的培养箱内孵育24 h，待细胞贴壁后，PBS液洗2次去除未贴壁细胞，然后加入不同浓度的匹罗卡品（每孔终浓度为1 mmol/L，0.5 mmol/L，0.1 mmol/L）及硫酸阿托品（每孔终浓度为0.1 mmol/L，0.01 mmol/L），匹罗卡品加硫酸阿托品组，每组重复5孔，阴性对照组不加药，分别于加药24 h、48 h、72 h后，每孔加入CCK-8溶液10μL。在细胞培养箱内继续孵育3 h，在450 nm测定吸光度。

1.6 流式细胞术分析M3受体激动剂及阻滞剂对RBE细胞凋亡的影响

取对数生长期的RBE细胞，以不同浓度匹罗卡品及硫酸阿托品进行处理，对照组以未加药干预的正常RBE细胞。培养48 h后，胰酶消化，收集细胞，用冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，1×结合缓冲液重悬细胞，制成单细胞悬液, 使其浓度为1×106/ml。取100μL细胞悬液，加入5μL Annexin V-FITC和10μL碘化丙锭（PI）溶液，混匀后室温避光孵育15 min；再加入400μL PBS。采用流式细胞仪（BD公司，FACSCaliber）CellQuest软件进行分析。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 RBE细胞中毒蕈碱型受体M3蛋白的表达情况

对照组、匹罗卡品组及匹罗卡品加阿托品组均出现M3受体蛋白条带（图1），以M3与GADPH的灰度比值来表示M3受体蛋白的相对表达数值（表1）。单用匹罗卡品组差异有统计学意义（F=61.86，P＜0.05）。匹罗卡品+硫酸阿托品组差异有统计学意义（F=54.51，P＜0.05）。正常对照组与阿托品组相比差异无统计学意义（F=1.45，P＞0.05）。

图1M3受体激动剂及阻滞剂对胆管癌细胞系RBE中毒蕈碱型受体M3蛋白表达的影响

表1 不同浓度匹罗卡品及阿托品对M3蛋白表达的影响

2.2 毒蕈碱型受体M3对RBE细胞增殖作用的影响

匹罗卡品对胆管癌细胞的增殖具有抑制作用，且其抑制作用呈浓度依赖。1 mmol/L匹罗卡品组及0.5 mmol/L匹罗卡品组与阴性对照组相比抑制作用明显（P＜0.05），而0.1 mmol/L匹罗卡品组与阴性对照组相比抑制作用不明显（P＞0.05）。且随抑制作用呈时间依赖性，随作用时间延长抑制作用逐渐减弱（1 mmol/L匹罗卡品组及0.5 mmol/L匹罗卡品组抑制作用在24 h、48 h、72 h时，呈减弱趋势（P＜0.05），而0.1 mmol/L匹罗卡品组随时间延长，抑制作用无差别（P＞0.05）阿托品+匹罗卡品组的吸光值明显高于相应匹罗卡品组的吸光值，即阿托品可以阻滞匹罗卡品对胆管癌细胞增殖的抑制作用。而阿托品组的吸光值与阴性对照组几乎无差别（P＞0.05），即阿托品本身对胆管癌的增殖无抑制作用。

2.3 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3对RBE细胞凋亡的影响

匹罗卡品组G1期细胞数与对照组相比，差别有明显统计学意义（P＜0.05），并且凋亡率也明显升高（P＜0.05）。匹罗卡品与阿托品共同作用于细胞后，G1期细胞数所占比例及凋亡率的升高明显受抑制。阿托品单独作用于细胞后，G1期细胞数所占比例及凋亡率与对照组相比无明显差异（P＞0.05）。（表3）。

表2 不同浓度的匹罗卡品及阿托品对胆管癌细胞增殖的影响

表3 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3对胆管癌细胞系RBE细胞周期及凋亡的影响

图2 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3对胆管癌细胞系RBE细胞凋亡的影响

3 讨论

目前，许多研究致力于神经递质与肿瘤之间的相互作用关系，特别是像胆管癌这种具有嗜神经浸润特性的肿瘤[4-6]。胆管系统是具有十分丰富自主神经的器官，副交感神经系统在肿瘤细胞发生发展中起着重要的作用[7-9]，其分泌的神经递质乙酰胆碱（acetylcholine，Ach）作用于效应细胞的胆碱能受体（AchR），以调节效应细胞的功能。已有研究表明，许多神经递质受体在肿瘤中异常表达，神经递质及其受体激动剂可以影响肿瘤细胞的增殖，分化及转移过程[10]，而其受体拮抗剂可阻断其作用。毒草碱型乙酰胆碱受体M3广泛分布于平滑肌和腺体细胞，调节许多重要的生理活动，如神经信号的传递、平滑肌收缩以及内外分泌等功能。我们研究发现胆管癌细胞系RBE在M3受体激动剂匹罗卡品的作用下，其M3受体的表达呈浓度依赖性，随匹罗卡品浓度的增加，蛋白的表达随之增加，在1 mmol/L匹罗卡品作用下，表达最多，且这种作用可被M3受体阻滞剂阿托品所抑制，提示在胆管癌中，毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3在其受体激动剂及阻滞剂的作用下，可通过上调或下调其表达，来参与调节胆管癌的分化及转移。

本组研究发现，匹罗卡品对胆管癌细胞的增殖具有抑制作用，且其抑制作用呈浓度依赖性，抑制作用随时间的延长而逐渐减弱。我们推断胆管癌中M3受体表达以及Ach的分泌，可能是机体对肿瘤发生所产生的一种细胞反应及防御机制。石胆酰牛磺酸及其他一些胆汁酸作为正常人体胆肠循环中的重要组成部分，是毒蕈碱样乙酰胆碱受体M3的部分激动剂。我们猜想各种原因引起的胆汁淤积致使M3受体激动剂减少，成为影响胆管癌预后的重要因素，那么临床上胆管癌患者早期使用PTCD引流的重要性由此可见。

许多种类的癌基因表达以后，即阻断了肿瘤细胞的凋亡过程，使肿瘤细胞数目增加。毒蕈碱受体激活不仅对细胞的凋亡具有保护作用，还可以参与细胞凋亡的发生或诱导细胞的凋亡[11]。我们的研究显示，1 mmol/L的匹罗卡品，作用于胆管癌细胞使胆管癌细胞中G1期的细胞数明显增加，同时，胆管癌细胞凋亡率也明显升高，表明匹罗卡品可通过M3受体作用于细胞，使细胞阻滞于G1期，进入S期、G2期的细胞减少，阻碍胆管癌细胞DNA的复制及胆管癌细胞的增殖，并且诱导胆管癌细胞的凋亡，其作用可被M3受体阻滞剂阿托品抑制。

胆管癌是耐药性实体瘤，虽然近年研究采用局部或联合化疗治疗胆管癌取得了一些进展，但真正有效的化疗药物和化疗方案很少。我们可以推测胆管癌的生长可以被副交感神经系统来调节，M3受体激动剂及阻滞剂对胆管癌增殖及凋亡的的影响，为胆管癌的药物治疗提供了新的思路。

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