十字花科作物根肿病生防菌研究进展

彭丽莎, 袁天成, 李成琼, 任雪松, 宋洪元, 司 军

(西南大学园艺园林学院,重庆市蔬菜学重点实验室,南方山地园艺学教育部重点实验室, 重庆 400715)



十字花科作物根肿病生防菌研究进展

彭丽莎, 袁天成, 李成琼, 任雪松, 宋洪元, 司 军*

(西南大学园艺园林学院,重庆市蔬菜学重点实验室,南方山地园艺学教育部重点实验室, 重庆 400715)

根肿病严重危害油菜、白菜、甘蓝、芥菜在内的十字花科作物,因此研究一种有效的防治方法以降低该病害的发生是非常重要的。十字花科作物根肿病的病原菌—根肿菌能以休眠孢子的形式长期存在于土壤中,一旦环境条件适宜即可萌发并迅速传播。生防菌是从拮抗病原菌和诱导植物抗性的角度寻求防治病害的一种方法。作者首先对获得十字花科作物根肿病生防菌的方法进行阐述,重点总结了生防菌的来源和筛选的方法。为了更好地利用生防菌,又简要综述了生防菌菌株的分类鉴定、发酵及拮抗物质等方面的研究进展,分析了施用生防菌的方式和时间。并指出了目前存在的问题及开发应用的前景。

十字花科; 根肿病; 生防菌; 生物防效

十字花科作物根肿病是由芸薹根肿菌(PlasmodiophorabrassicaeWoronin)侵染引起的土传病害[1-4],该病主要危害十字花科作物的根部。导致生长素、细胞分裂素[5-7]以及油菜素甾醇[8]的过度合成,从而引起主根和侧根形成大量肿瘤,严重者整株枯死[9-10],造成严重的经济损失。根肿菌专性寄生于十字花科作物,在土壤中可长期存活,土壤一旦带菌将不再适合栽植十字花科作物。因此,该病严重威胁着十字花科作物的可持续发展。

国内外虽已进行了大量针对该病原菌防治技术的研究,但目前仍无根治的方法。选用抗病品种是防治根肿病的有效方法之一,根据Williams[11]和Buczacki等[12]建立的欧洲鉴别寄主系统(European clubroot differential set,ECD)将根肿菌分为24个生理小种,因此要选育具有普遍抗性(即水平抗性)的品种难度非常大。轮作能在一定程度上缓解根肿病情[13-15],但增加了侵染十字花科杂草的机会,仍然不能从根本上消灭根肿菌。化学药剂治理虽有一定效果,但同时也有诸多副作用,如农药残留、环境污染、病原菌产生抗药性、破坏土壤微生态环境等。随着生活质量的提高,人们对生态农业的关注也日益加深,利用微生物防治病虫害也越来越受到重视。Arie等[16]首次报道利用葡萄茎枯病菌(Phomaglomerata)JCM 9972可以抑制根肿菌休眠孢子的萌发。最新的研究表明生防菌不仅有抗菌活性,还可以诱导寄主植物产生抗性[17-18]。生防菌为控制该病提供了一条新的有效途径。近年来在利用微生物防治十字花科作物根肿病方面的研究取得了较大进展。本文将对十字花科作物根肿病的微生物防治研究进展做简要综述,旨在为根肿病生防菌的开发利用提供参考。

1 生防菌的获得

1.1 生防菌的来源

按材料来源,生防菌主要分为内生生防菌和非内生生防菌两类。非内生生防菌即从根际土壤中分离筛选所得的生防菌。土壤中微生物的多样性为从土壤中分离生防菌提供了保证,取材时应取发病地中未发病或病害等级较低植株的根际土壤,以提高从中筛选出生防菌的可能性。国内外常有从富含微生物的土壤中筛选生防菌的报道。国外学者得到的25株对根肿菌有拮抗活性的木霉属生防菌均是从种植商品品种无根肿病症状的土壤中分离的[19]。苏婷等[20]从不同地区土壤中分离出细菌596株,其中解淀粉芽胞杆菌BS2004经周青等[21]证实其兼具抑制番茄青枯病和芸薹根肿菌的作用。王靖等[22]从白菜根际土壤中分离得到拮抗根肿菌的放线菌A316。

农药和化肥的大量使用降低了土壤中微生物的多样性,给根际土壤生防菌的筛选带来了一定困难。内生菌因受到植物组织的保护而免受外界环境的影响,所处的生态环境稳定且能与病菌直接作用。因而从植物组织中筛选出生防菌的可能性更大,更易于发挥生防作用。内生生防菌广泛分布于植物组织中,与植物形成互惠共生关系[23-25],大量研究表明内生菌是植物土传病害防治的天然有效菌[26-27],具有一定研究价值和开发应用前景。Narisawa等[28-29]以及Hashiba等[30]从白菜根系中分离出2株内生生防菌Heteroconiumchaetospira和Phialocephalafortinii,分别接种该生防菌的白菜田间根肿病发病率可降低52%～97%。Hahm等[31]也从白菜组织中分离出黄杆菌属内生细菌FlavobacteriumhercynimEPB-C313,可以在一定程度上抑制根肿病的发生。生命力旺盛且抗病力强的植株体内可能蕴含着丰富的微生物资源,因此可以扩大范围甚至跨科采集生防菌原始材料,以筛选优良的生防菌菌株。如王靖等[32]从雅安红豆树根部和银杏树根部分别成功分离出放线菌A10和真菌T1,具有较高生防潜力。

1.2 生防菌的分离纯化和筛选

从材料中获取的微生物需要进一步分离纯化,方法同常用的分离纯化微生物的方法,多采用稀释涂布法和平板画线法。两种方法都应该在分别适合细菌、真菌、放线菌生长的培养基上进行。所不同的是用稀释涂布法分离纯化微生物时,需要根据微生物数量的多少做预试验找到适当的稀释比[33]。

芸薹根肿菌是一种专性活体寄生菌,不容易体外培养[34-35],因而也很难得到人工纯培养的根肿菌来筛选根肿病生防菌。目前根肿病生防菌的筛选方法主要有活体鉴定法、休眠孢子萌发抑制率筛选法及病原指示菌筛选法等。活体鉴定法费地费时费力,一般在复筛阶段开始采用,以准确确定初筛菌株的生物防效。休眠孢子萌发抑制率筛选法即通过检测微生物对根肿菌休眠孢子萌发的抑制作用来筛选生防菌。该种方法也存在一定缺陷,并不是所有具生防潜力的微生物都可以抑制根肿菌休眠孢子的萌发。如Jäschke等[36]在筛选拟南芥根肿病的生防菌时发现芳香顶孢霉(Acremoniumalternatum)孢子对根肿菌休眠孢子的萌发无抑制作用,却能在一定程度上抑制根肿病的发生。孙良菲等[37]将病原指示菌筛选法和休眠孢子萌发抑制率筛选法结合使用筛选出2株生防菌株放线菌YN-6和真菌XP-F2对感病品种‘四季奶油小白菜’有生物防效。病原指示菌筛选法和休眠孢子萌发抑制率筛选法结合起来的具体做法是挑选能人工培养的病菌作为病原指示菌,先筛选出对几种病菌有拮抗效果的菌株作为测定休眠孢子萌发抑制率的候选菌株。两者结合使用既克服了前者目标性不强的缺点,又克服了后者由于根肿菌不能体外培养而难以筛选的不足。

2 菌株的分类鉴定

经分离纯化筛选得到的生防效果较好的生防菌需要确定其在进化中的地位,以便后续工作的顺利开展。以往的研究常依靠形态学特征和生理生化特征进行菌株分类鉴定。常规鉴定方法检测指标多、工作量大,且单纯依靠常规方法难以达到准确鉴定的目的。如果生防菌是真菌,因为菌落、菌丝体和孢子特别是大型真菌的子实体和孢子的形态特征容易观察和比较,所以常规鉴定方法对于真菌的鉴定依然很重要。常规鉴定方法的局限性限制了菌株分类鉴定的发展,越来越多的分类单元鉴定需要结合分子生物学技术和自动鉴定系统才能实现。基因序列分析法和Biolog微生物自动鉴定系统是目前国际上常用的分类鉴定方法[38]。rDNA-ITS序列分析法、18S rDNA和16S rDNA序列分析法是基因序列分析法中常用的3种分类鉴定方法。其中rDNA-ITS序列分析法是对核糖体RNA基因(即rDNA)内转录间隔区(ITS)的多态性序列进行PCR扩增,获得ITS全序列信息,经测序后与基因库中的片段进行对比分析,就可得知未知菌与基因库中已知菌的相似度,从而完成对菌株分类单位的鉴定以明确真菌的分类地位。16S rDNA是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16S rRNA)的基因。16S rRNA长度在1 500 bp左右,所代表的信息量适中,是研究原核分类的理想材料。根据16S rDNA两端的保守序列设计引物,扩增16S rRNA基因的未知部分,再测序和已知细菌的序列对比分析确定病原细菌的分类地位。Lee等[39]运用16S rDNA序列分析法把从韩国田间种植的白菜上分离得到的81株内生放线菌划分为8个不同的属,其中最常见的是小双孢菌属(67%),其次是链霉菌属(12%)和小单孢菌属(11%)。并且通过室内盆栽试验,以细胞壁成分、形态特征和系统发育为依据,将其中能有效抑制根肿病的3株生防菌确定为玫瑰小双孢菌(A004和A011)和橄榄色链霉菌(A018)。范成明等[40-41]采用细菌通用引物P0和P6,于2007年在国内首次将16S rDNA序列分析法用于根肿病生防菌的鉴定,经比对并结合形态特征发现生防菌XF-1属枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)。王靖等[22]采用PCR引物27F、1492R,将生防放线菌菌株A316鉴定为灰红链霉菌,结合形态与培养特征、生理生化特性把菌株A10划分至链霉菌灰褐类群。18S rDNA 序列分析法与16S rDNA 序列分析法类似,所不同的是,前者用于鉴定真菌。

然而基因序列分析法和Biolog微生物自动鉴定系统仍然有缺陷。基因序列分析法可以准确地将菌株鉴定到属,但使用的前提是基因库中存在和扩增序列同源的片段;并且这种方法不能将种间遗传距离非常近的菌株的分类地位确定到种的水平。美国Biolog公司以碳源的利用情况为基础研制开发的Biolog微生物自动鉴定系统可用于包括根肿病生防菌在内的各种微生物的鉴定,然而检测结果发现只能测定微生物的部分性状,容易产生误判[42],具有一定的局限性。因此,将借助于分子生物学等手段的新方法与常规方法结合使用以更加准确地鉴定根肿病生防菌更为可取。

3 生防菌的发酵

获得了优良的生防菌菌株之后,建立合理的培养及发酵体系,扩大培养发酵才能实现大面积的推广应用。对生防菌的发酵过程进行合理优化,可以提高目的产物的产量并有效降低发酵成本,为其在生产中应用奠定基础。发酵过程包括菌株自身的性能、发酵培养基的组成以及合适的环境条件等。王靖[43]首先采用单因素分析方法确定最佳的培养基组成(含大豆粉、酵母膏、葡萄糖及蛋白胨等),再采用复合因素分析方法(正交设计)确定最优的培养条件组合(包括种子液种龄、接种量、初始pH、装液量、温度、摇床转速及发酵时间等),确定菌株A316和A10的较佳培养基组成及理想的发酵培养条件。除此之外,响应面设计、均匀设计、模式识别法、二次正交旋转组合法、遗传算法和神经网络等[44]分析方法也可用于培养条件的优化,应根据实际情况合理选择以上分析方法。另外,在生防菌株的生理代谢和合成调控机制未知的情况之下,可通过摇瓶培养先用Plackett-Burman法确定出重要因素,然后用响应面优化设计法或均匀设计法得到各重要因素的最佳水平[45],从而筛选适宜的培养体系。

4 拮抗物质的分离与鉴定

微生物代谢物质对土传病害的防治作用也是国内外学者关注的热点。曾有报道指出生防菌葡萄茎枯病菌JCM 9972对根肿病有一定防治作用,其控制根肿病发生的拮抗物质是发酵液中的顶环氧菌素[16]。贾媛等[46]采用盐酸和甲醇抽提法从枯草芽胞杆菌XF-1中分离出拮抗物质而后用其处理根肿菌休眠孢子,9 d后发现休眠孢子萌发的相对抑制率在90%以上。Li等使用层析分离技术从枯草芽胞杆菌XF-1分离出一种抗菌肽芬荠素类型环肽(fengycin-type cyclopeptides)[47],并用它(250 mg/mL)处理根肿菌休眠孢子,24 h后几乎观察不到完整的休眠孢子细胞[48]。拮抗物质可能存在于真菌的菌丝体和发酵液中,如存在于菌丝体中,则需要先用有机溶剂进行浸取,使样品从菌丝体中转移到有机溶剂中。王靖[43]发现在生防放线菌A316的菌丝体和发酵液中均含有拮抗物质,采用80%的丙酮浸泡24 h后,离心去除菌丝体,真空旋转蒸干,而后用10%甲醇溶解得到菌丝体浸泡液。将菌丝体浸泡液过滤后与发酵上清液合并置于正丁醇中萃取并经过薄层层析、硅胶柱层析等过程,最终分离纯化获得抗根肿病活性成分。经气相色谱-质谱(GC-MS)联用检测分析发现化合物Ⅰ与通用型酚类抗氧剂2,2′-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)的匹配度高达97.84%;化合物Ⅱ与邻苯二甲酸单乙基己基酯的匹配度为74.28%。除此之外,已报道对十字花科作物根肿病有拮抗作用的物质还有糖类细菌素[49]、几丁质酶[50]等,这些活性物质对根肿病均有不同程度的抑制作用。

5 生防菌的生物防效

在温室条件下进行试验得到的生防效果属于温室生物防效。相较于大田生物防效,温室生物防效通常会高于大田生物防效。多是直接将筛选得到的生防菌施用于植株的根际,也有的是利用生防菌分泌的拮抗物质。因为有学者研究发现同一种生防菌的细胞抑制休眠孢子的萌发率高于培养液高于培养滤液[31],表明直接用生防菌的生防潜力高于拮抗物质。在白菜移植前用F.hercynimEPB-C313培养液浸渍处理幼苗根系,对根肿病的抑制率可达100%[31]。内生生防菌可能需要在植株体内定殖以扩大生物量才能发挥拮抗作用,外国研究者通过光学和电子显微镜发现H.chaetospira在接种3周后才能进入根部表皮细胞[51],所以施用内生生防菌时应特别注意施用的时间。Wang等[52]的研究表明,A316菌株对白菜根肿病的温室生物防效和大田生物防效都高于阳性对照—75%百菌清可湿性粉剂,且能使白菜的单产增加96.1%[22]。大田生物防效的处理是在栽植幼苗前用A316菌株的发酵液与上层15 cm 的土壤混匀,并在栽植10 d 和25 d 后各浇发酵液于根系一次[52]。王靖等[32]采用灌根法分别将生防菌A316、A10和T1的培养液浇油菜植株根部4次(播种前7 d、播种期、播种后10 d、 播种后25 d),研究结果显示温室生物防效依次为73.60%、70.94%、67.10%,大田生物防效分别是65.84%、59.59%、61.24%。将生防菌与适宜的有机肥混合,除了可以利用有机肥对土壤的缓冲作用以改善生防菌生存的环境条件,从而达到增强防效的目的;还能利用有机肥中本身含有的各种有益微生物的辅助功效,协同作用防治根肿病[53]。Lahlali等[54]的研究结果显示加入枯草芽胞杆菌(B.subtilis) QST713自身产生的代谢物质有利于生防菌的定殖,同时还能使它与其他微生物之间的竞争最小化,也可间接提高防效。另外,一些研究者混合2种及2种以上的生防菌用于土传病害的防治。如Peng等[55]混合枯草芽胞杆菌和海洋真菌链孢黏帚菌(Gliocladiumcatenulatum)2种生防菌使根肿病发生的严重程度降低80%以上。尽管混合的生防菌之间可能存在拮抗作用而降低生防效果,但是这种混合菌剂与单独使用一种相比,可能更易于生防菌的定殖。综合衡量拮抗作用和定殖情况,混合菌剂更有可能提高生防效果。

6 存在的问题和前景展望

6.1 存在的问题

生防菌由于对环境安全无污染而受到广泛重视。我国十字花科作物根肿病生防菌研究起步较晚,与发达国家相比还存在一定的差距,目前仍存在诸多问题制约着生防菌的进一步推广和应用。研究的一般程序是先分离、纯化、培养,然后是初筛和复筛并鉴定菌株,最后是定殖状况和发酵条件的研究。筛选、鉴定分别存在以下问题:其一,分离、纯化和培养过程均是在人工培养基上进行,尽管尝试采用多种人工培养基离体培养,仍然难以对生防效果较好却无法人工培养的微生物进行筛选[56-57];其二,由于内生菌长期生活在植物组织内部并与宿主植物协同进化,当在人工培养基上培养时其形态特征必然发生一定的变化以适应其内生环境[58-59]。那么基于形态学分类标准的传统鉴定方法就有可能无法正确反映内生生防菌的分类地位。另外初筛完成后复筛过程和防效试验需要不断地培养、繁殖和接种根肿菌,虽然此过程更加接近田间生长模式,但同时也存在病害传播及大面积蔓延的风险[60]。

多数生防菌在实验室内有较好的防效,在田间应用时却不甚理想。究其原因一方面是生防菌(尤其是非内生生防菌)在农作物上难以定殖。生防菌不能很好地在土壤或植株中定殖便难以形成足够数量的微生物群体,也就不能稳定发挥其防效。过高的农药残留可能也是导致微生物群体数量下降的原因之一。另一方面,目前的生物菌剂多是活菌,田间应用时极易受温湿度、pH等环境条件的制约,从而影响生防菌发挥对根肿病的拮抗作用。

土壤中存在各种微生物群落,不同的微生物之间存在复杂的相互作用。根肿病生防菌的引入,可能对土壤中其他微生物的群落结构造成不同程度的改变,继而打破固有的土壤微生态平衡。Roesti等[61]报道,接种PGPR假单胞菌和丛枝菌根真菌(AMF)对小麦根际土壤细菌群落有显著影响。类似的结果还有,朱伟杰等[62]也发现生防菌对土壤微生物中细菌的生物量具有促进作用。生防菌的使用在短时间内可能对根肿菌有较好防效,但生防菌的加入同时也可能会影响土壤微生态平衡和降低生物多样性[63],甚至导致新病害的出现。从长远的角度考虑,应兼顾经济效益、生态效益和社会效益,在有效防治根肿病的同时严格控制生防菌的引入量,以避免产生新的隐患。

6.2 前景展望

根肿病生防菌的开发利用,给根肿病的综合防治提供了新的思路。如何使十字花科作物根肿病生防菌在生产上得到有效的推广和应用是目前生防菌研究的主攻方向。为了达到提高生防效果的目的,除了改变生防菌的施用方式和掌握施用时间外,还可以把筛选出的生防菌加以诱变处理。常见诱变的方式有紫外线诱变[64]、氯化锂诱变[65]、N+注入诱变[66]、微波诱变[67]、硫酸二乙酯诱变[68]等,上述诱变方式不仅可单独处理还可复合使用。还可以利用现代分子生物学手段,将生防菌中的抗病基因整合到十字花科作物体内。Feng等[69]将潮霉素抗性基因(hph)整合到根肿菌的基因中得到含抗潮霉素活性的根肿菌,并将其接种到油菜上发现肿根可以形成。通过PCR和qPCR分析表明转化的DNA仍然存在于根肿菌。这是首次报道遗传转化的根肿菌,将有利于根肿病植物病害系统多项领域的研究。这为生防菌和植物中的抗病基因整合到根肿菌体内提供技术支持。在分子水平提高抗病性,从根本上解决根肿病的危害问题。这也是未来生防菌研究的热点。

由于根肿菌是寄生于十字花科作物的专性活体寄生菌,很难直接得到纯培养的单孢菌系。Kageyama和Asano[70]试验的结果表明采用单孢接种技术以及细胞悬浮培养技术可以对根肿菌进行离体培养,但不能获得大量的肿根,该方法的适用性尚待验证。探究根肿菌离体培养方法,建立科学实用的根肿菌离体培养体系,开发生防菌筛选新方法提高筛选效率仍然是当前迫切需要解决的问题。

理想的目标生防菌需具有高效、稳定等特性,实现其功能的最大化,最好兼具增产等功效。结合现代生物技术,加强对根肿病生防菌定殖、消长规律等基础理论问题的研究,注重生防菌的田间防效,发掘和利用生防菌的防治潜力,提高生产应用价值,逐渐取代部分化学农药的使用,实现低成本、安全、无污染、增产增质的目标,根肿病生物防治才有可能取得突破性进展。

[1] Suwabe K, Tsukazaki H, Iketani H, et al. Simple sequence repeat-based comparative genomics betweenBrassicarapaandArabidopsisthaliana: the genetic origin of clubroot resistance[J].Genetics, 2006, 173(1): 309-319.

[2] Hwang S F, Strelkov S E, Feng J, et al.Plasmodiophorabrassicae: a review of an emerging pathogen of the Canadian canola (Brassicanapus) crop [J].Molecular Plant Pathology, 2012, 13(2): 105-113.

[3] Verma S S, Rahman M H, Deyholos M K, et al. Differential expression of miRNAs inBrassicanapusroot following infection withPlasmodiophorabrassicae[J].PLoS ONE, 2014, 9(1): e86648.

[4] 陈慧慧,张腾,梁珊,等.大白菜抗根肿病CRb基因紧密连锁标记的开发与定位[J].中国农业科学,2012,45(17):3551-3557.

[5] Päsold S, Ludwig-Müller J. Reduction of clubroot (Plasmodiophorabrassicae) formation inArabidopsisthalianaafter treatment with prohexadione-calcium, an inhibitor of oxoglutaric acid-dependent dioxygenases [J].Plant Pathology, 2013, 62(6): 1357-1365.

[6] Ludwig-Müller J, Prinsen E, Rolfe S A, et al. Metabolism and plant hormone action during clubroot disease[J].Journal of Plant Growth Regulation, 2009, 28(3): 229-244.

[7] Siemens J, Keller I, Sarx J, et al. Transcriptome analysis ofArabidopsisclubroots indicate a key role for cytokinins in disease development[J].Molecular Plant-Microbe Interactions, 2006, 19(5): 480-494.

[8] Schuller A,Kehr J, Ludwig-Müller J. Laser microdissection coupled to transcriptional profiling ofArabidopsisroots inoculated byPlasmodiophorabrassicaeindicates a role for brassinosteroids in clubroot formation [J].Plant and Cell Physiology, 2014, 55(2): 392-411.

[9] Ludwig-Müller J, Schuller A. What can we learn from clubroots: alterations in host roots and hormone homeostasis caused byPlasmodiophorabrassicae[J].European Journal of Plant Pathology, 2008, 121(3): 291-302.

[10]Snyder W C, Leach D, Sciaroni R H. Chemical control of clubroot [J].California Agriculture, 1955, 9(4): 8-10.

[11]Williams P H. A system for the determination of races ofPlasmodiophorabrassicaethat infect cabbage and rutabaga[J].Phytopathology, 1966, 56: 624-626.

[12]Buczacki S T, Toxopeus H, Mattusch P, et al. Study of physiologic specialization inPlasmodiophorabrassicae: Proposals for attempted rationalization through an international approach[J].Transactions of the British Mycological Society, 1975, 65(2): 295-303.

[13]Klasse H J. Calcium cyanamide-an effective tool to control clubroot-a review[J].Acta Horticulturae (ISHS), 1996, (407): 403-409.

[14]Wallenhammar A C. Prevalence ofPlasmodiophorabrassicaein a spring oilseed rape growing area in central Sweden and factors influencing soil infestation levels[J].Plant Pathology, 1996, 45(4): 710-719.

[15]Wallenhammar A C, Johnsson L, Gerhardson B.Agronomic performance of partly clubroot-resistant spring oilseed turnip rape lines [J].Journal of Phytopathology, 2000, 148(7-8): 495-499.

[16]Arie T, Kobayashi Y, Okada G, et al. Control of soilborne clubroot disease of cruciferous plants by epoxydon fromPhomaglomerata[J].Plant Pathology, 1998, 47(6): 743-748.

[17]Lahlali R, Peng G, Gossen B D, et al. Evidence that the biofungicide Serenade (Bacillussubtilis) suppresses clubroot on canola via antibiosis and induced host resistance [J].Phytopathology, 2013, 103(3): 245-254.

[18]Lahlali R, McGregor L, Song T, et al.Heteroconiumchaetospirainduces resistance to clubroot via upregulation of host genes involved in jasmonic acid, ethylene, and auxin biosynthesis [J].PloS ONE, 2014, 9(4): e94144.

[19]Cheah L H, Page B B C.Trichodermaspp. for potential biocontrol of clubroot of vegetable brassicas [C]∥Proceedings of the New Zealand Plant Protection Conference. New Zealand Plant Protection Society Inc, 1997: 150-153.

[20]苏婷, 路梅, 周青, 等.抗不同生化型青枯菌的生防菌筛选鉴定及其活性分析[J].植物保护学报, 2010, 37(5): 431-435.

[21]周青, 王笑, 苏婷, 等.青枯病和根肿病生防细菌BS2004的发酵培养基和培养条件优化[J].中国生物防治学报, 2012, 28(4): 537-544.

[22]王靖, 黄云, 姚佳, 等. 两株根肿病生防放线菌的鉴定及其防病效果[J].中国农业科学, 2011, 44(13): 2692-2700.

[23]Saikkonen K, Wäli P, Helander M, et al. Evolution of endophyte-plant symbioses [J]. Trends in Plant Science, 2004, 9(6): 275-280.

[24]Faeth S H. Are endophytic fungi defensive plant mutualists?[J].Oikos, 2002, 98(1): 25-36.

[25]郭良栋.内生真菌研究进展[J].菌物系统,2001,20(1):148-152.

[26]Cheah L H, Veerakone S, Kent G. Biological control of clubroot on cauliflower withTrichodermaandStreptomycesspp.[J].New Zealand Plant Protection, 2000(53): 18-21.

[27]Doan T T, Jäschke D, Ludwig-Müller J. An endophytic fungus induces tolerance against the clubroot pathogenPlasmodiophorabrassicaeinArabidopsisthalianaandBrassicaraparoots [J].Acta Horticulturae (ISHS),2010(867):173-180.

[28]Narisawa K, Ohki K T, Hashiba T. Suppression of clubroot andVerticilliumyellows in Chinese cabbage in the field by the root endophytic fungusHeteroconiumchaetospira[J].Plant Pathology, 2000, 49(1): 141-146.

[29]Narisawa K, Tokumasu S, Hashiba T. Suppression of clubroot formation in Chinese cabbage by the root endophytic fungus,Heteroconiumchaetospira[J].Plant Pathology, 1998, 47(2): 206-210.

[30]Hashiba T, Narisawa K. The development and endophytic nature of the fungusHeteroconiumchaetospira[J].FEMS Microbiol Letters, 2005, 252(2): 191-196.

[31]Hahm S, Kim J, Han K, et al. Biocontrol efficacy of endophytic bacteriaFlavobacteriumhercynimEPB-C313 for control of Chinese cabbage clubroot[J].Research in Plant Disease, 2012, 18(3): 210-216.

[32]王靖,黄云,张艳,等.油菜根肿病菌拮抗微生物的筛选及其防治效果测定[J].中国油料作物学报,2011,33(2):169-174.

[33]黄世文, 高成伟, 王玲, 等.土壤中有益放线菌的高效分离, 筛选和生物测定技术[J].植物保护, 2008,34(1): 138-141.

[34]Arnold D L, Blakesley D, Clarkson J M. Evidence for the growth ofPlasmodiophorabrassicaeinvitro[J].Mycological Research, 1996, 100: 535-540.

[35]Asano T, Kodama A, Kageyama K. Susceptibility of hairy root lines ofBrassicaspecies toPlasmodiophorabrassicaeand in aninvitrosubculture system [J].Journal of General Plant Pathology, 2006, 72(2): 85-91.

[36]Jäschke D, Dugassa-Gobena D, Karlovsky P, et al. Suppression of clubroot (Plasmodiophorabrassicae) development inArabidopsisthalianaby the endophytic fungusAcremoniumalternatum[J].Plant Pathology, 2010, 59(1): 100-111.

[37]孙良菲, 任佐华, 彭沙莎, 等.白菜根肿病菌拮抗微生物的筛选及防治效果评价[J].湖南农业科学, 2013(1): 84-87.

[38]Kim C H, Lee J H, Heo J H, et al. Cloning and expression of a novel esterase geneCpoAfromBurkholderiacepacia[J].Journal of Applied Microbiology, 2004, 96(6): 1206-1316.

[39]Lee S O, Choi G J, Choi Y H, et al. Isolation and characterization of endophytic actinomycetes from Chinese cabbage roots as antagonists toPlasmodiophorabrassicae[J].Journal of Microbiol and Biotechnology, 2008, 18(11): 1741-1746.

[40]范成明. 土壤生物消毒对大白菜根肿病的防效评估及防治机理研究[D].昆明: 云南农业大学, 2007.

[41]熊国如, 赵更峰, 范成明, 等. 生防菌株XF-1的鉴定和抑菌谱的测定[J].云南农业大学学报, 2009, 24(2): 190-194.

[42]Marten P, Smalla K, Berg G. Genotypic and phenotypic differentiation of an antifungal biocontrol strain belonging toBacillussubtilis[J].Journal of Applied Microbiology, 2000, 89(3): 463-471.

[43]王靖. 十字花科作物根肿病生防放线菌研究[D].雅安: 四川农业大学, 2011.

[44]肖怀秋, 李玉珍. 微生物培养基优化方法研究进展[J].酿酒科技, 2010(1): 90-94.

[45]陆燕,梅乐和,陆悦飞,等.响应面法优化工程菌产细胞色素P450BM-3的发酵条件[J].化工学报,2006,57(5):1187-1192.

[46]贾媛,孙睿揆,吴毅歆,等.枯草芽孢杆菌XF-1提取物对11种植物病原菌的抑制作用[J].安徽农业大学学报,2011,38(5):753-756.

[47]Li X Y, Mao Z C, Wang Y H, et al. ESI LC-MS and MS/MS characterization of antifungal cyclic lipopeptides produced byBacillussubtilisXF-1[J].Journal of Microbiology and Biotechnology, 2012, 22(2): 83-93.

[48]Li X Y, Mao Z C, Wang Y H, et al. Diversity and active mechanism of fengycin-type cyclopeptides fromBacillussubtilisXF-1 againstPlasmodiophorabrassicae[J].Journal of Microbiology and Biotechnology, 2013, 23(3): 313-321.

[49]湖北省生物农药工程研究中心.一种抑制芸苔根肿菌的解淀粉芽胞杆菌及其活性物质的分离与应用:中国,CN20111028-4741.3[P].2012-3-21.

[50]Joo G J, Kim Y M, Kim J W, et al. Biocontrol of cabbage clubroot by the organic fertilizer usingStreptomycessp. AC-3[J].Korean Journal of Microbiology and Biotechnology, 2004, 32(2): 172-178.

[51]Miho Y, Fumiaki U, Narisawa K, et al. Anatomical study on the interaction between the root endophytic fungusHeteroconiumchaetospiraand Chinese cabbage [J].Mycoscience, 2004, 45(6): 367-371.

[52]Wang J, Huang Y, Lin S, et al. A strain ofStreptomycesgriseoruberisolated from rhizospheric soil of Chinese cabbage as antagonist toPlasmodiophorabrassicae[J]. Annals of Microbiology, 2012, 62(1): 247-253.

[53]张志红, 李华兴, 韦翔华, 等. 生物肥料对香蕉枯萎病及土壤微生物的影响[J].生态环境, 2008, 17(6): 2421-2425.

[54]Lahlali R, Peng G, McGregor L, et al. Mechanisms of the biofungicide serenade (BacillussubtilisQST713) in suppressing clubroot [J].Biocontrol Science and Technology, 2011, 21(11): 1351-1362.

[55]Peng G, McGregor L, Lahlali R, et al. Potential biological control of clubroot on canola and crucifer vegetable crops [J].Plant Pathology, 2011, 60(3): 566-574.

[56]Rappé M S, Giovannoni S J. The uncultured microbial majority[J].Annual Review of Microbiology, 2003, 57: 309-394.

[57]王保军, 刘双江. 环境微生物培养新技术的研究进展[J].微生物学通报, 2013, 40(1): 6-17.

[58]郑红. 紫外辐射对青藏高原植物内生细菌多样性的影响[D].兰州: 兰州大学, 2009.

[59]肖春玲, 肖力, 李晓红. 黄花夹竹桃内生细菌抑菌活性的初步研究[J].安徽农业科学, 2006, 34(23): 6246-6248.

[60]李金萍, 柴阿丽, 孙日飞, 等. 十字花科蔬菜根肿病研究新进展[J].中国蔬菜, 2012(8): 1-4.

[61]Roesti D, Gaur R, Johri B N, et al. Plant growth stage, fertiliser management and bio-inoculation ofArbuscularmycorrhizalfungi and plant growth promoting rhizobacteria affect the rhizobacterial community structure in rain-fed wheat fields [J].Soil Biology and Biochemistry,2006,38(5):1111-1120.

[62]朱伟杰, 王楠, 郁雪平, 等. 生防菌Pseudomonasfluorescens2P24对甜瓜根围土壤微生物的影响[J].中国农业科学, 2010, 43(7): 1389-1396.

[63]文才艺, 吴元华, 田秀玲. 植物内生菌研究进展及其存在的问题[J].生态学杂志, 2004, 23(2): 86-91.

[64]刘晓妹,张显,殷丽华,等.杧果蒂腐病生防菌诱变育种及其与常用农药优化组合筛选[J].中国南方果树,2012,41(6):15-19.

[65]易龙, 田艳, 吴显佳, 等. 枯草芽孢杆菌Ata28生防菌株诱变改良及其控病影响[J].西南大学学报: 自然科学版, 2008, 30(1): 51-57.

[66]陈志谊, 李德全. 生防菌Bs-916离子注入突变高效菌株筛选及对水稻纹枯病的防治效果[C].绍兴: 2005年华东植物病理学术研讨会论文集, 2005.

[67]王玲, 刘小钟, 袁虹霞, 等. 小麦纹枯病生防菌株S024的诱变育种研究[J].河南农业大学学报, 2006, 40(6): 622-626.

[68]林姗. 十字花科根肿病菌Plasmodiophorabrassicae生防菌的筛选及其诱变选育[D].雅安: 四川农业大学, 2012.

[69]Feng J, Hwang S F, Strelkov S E. Genetic transformation of the obligate parasitePlasmodiophorabrassicae[J].Phytopathology, 2013, 103(10): 1052-1057.

[70]Kageyama K, Asano T. Life cycle ofPlasmodiophorabrassicae[J].Journal of Plant Growth Regulation, 2009, 28(3): 203-211.

(责任编辑：田 喆)

Research progresses in biocontrol bacteria of the clubroot disease of the Cruciferae

Peng Lisha, Yuan Tiancheng, Li Chengqiong, Ren Xuesong, Song Hongyuan, Si Jun

(College of Horticulture and Landscape Architecture,Southwest University, Chongqing Key Laboratory of Horticulture, Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions, Ministry of Education, Chongqing 400715, China)

Clubroot is becoming a serious threat to cruciferous crops, includingBrassicanapus,B.pekinensis,B.oleracea,B.juncea. It is very important to develop an effective control method to reduce the occurrence of this disease.Plasmodiophorabrassicae, which causes clubroot disease in cruciferous crops, can form resting spores surviving for long periods in the soil. If the environmental conditions are suitable for the germination ofP.brassicaeresting spores, this disease spreads quickly. Biocontrol microorganisms suppress clubroot of cruciferous crops via antibiosis and induced host resistance. The present review focuses on research progresses in the methods of acquiring biocontrol microorganisms. We emphatically summarize the sources and screening methods of biocontrol microorganisms. In order to make better use of biocontrol microorganisms, advances in classification, fermentation and antagonistic substances of biocontrol microorganisms and an analysis of the methods and time for applying biocontrol microorganisms are reviewed. The problems to be solved and prospects for development and application were also discussed.

Cruciferae; clubroot disease; biocontrol microorganisms; biocontrol efficiency

2014-05-20

2014-07-04

国家科技支撑计划项目(2012BAD02B01)；重庆市农作物良种创新工程(CSTC2012GG(80005))；中央高校基本科研业务费专项资金(XDJK2014C179，XDJK2014C181，XDJK2014A015)

S 476

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.04.003

* 通信作者 E-mail：sijunxx@163.com