外源S2-抑制水稻生长及土壤微生物活性的半效应浓度研究

2015-01-27谢晓梅徐培智徐昌旭刘光荣

植物营养与肥料学报 2015年5期

谢晓梅，廖敏*，张楠，徐培智，徐昌旭，刘光荣

(1浙江大学环境与资源学院，杭州 310058； 2浙江省亚热带土壤与植物营养重点研究实验室，杭州 310058；3广东省农业科学院土壤肥料研究所，广州 510640； 4江西省农业科学院土壤肥料与资源环境研究所，南昌330200)

谢晓梅1,2，廖敏1,2*，张楠1,2，徐培智3，徐昌旭4，刘光荣4

【目的】S2-是冷浸田类低产稻田中水稻生长的重要限制因子，探讨S2-对土壤-水稻生态系统的生态毒性特征，可为揭示冷浸田土壤S2-毒害临界值及其机理研究提供理论依据。【方法】以单季常规晚粳稻秀水134为材料，采用盆栽试验模拟冷浸田土壤S2-毒害，设外加S2-0、10、50、100、300、600和1200 mg/kg，在水稻苗期和分蘖期调查水稻生长，叶片叶绿素含量、脯氨酸和抗氧化酶系统活性，土壤微生物活性。【结果】在含一定S2-本底(12.08 mg/kg)的正常稻田土壤中，随外源S2-的加入量增加，对水稻生长的抑制逐步增强。当外源S2-浓度超过50 mg/kg后，水稻的株高、干物质积累量显著降低；水稻叶片生理指标叶绿素含量(SPAD值)、脯氨酸含量、抗氧化酶系统活性则显著增加，表明50 mg/kg是本研究条件下外源S2-对水稻生长产生显著毒害影响的临界点；随外源S2-浓度的增加土壤微生物量碳、微生物三大基础菌系总量、功能菌系总量和微生物总量都随外源S2-处理水平的增大而降低，硫化细菌总量随之增加，土壤S2-浓度40 mg/kg(含本底)为多数土壤微生物活性指标(微生物基础菌系总量、功能菌系总量、微生物总量)EC50变化的临界值；体系中土壤微生物活性指标和水稻生长存在显著相关,表明供试土壤S2-对水稻生长的影响是S2-对土壤-植物-土壤微生物系统同步影响的综合结果。可见，供试土壤S2-浓度40 mg/kg为导致土壤-水稻-土壤微生物系统受到显著负效应的临界值。【结论】土壤中S2-超过一定浓度将对土壤-水稻-土壤微生物系统产生显著负效应，S2-浓度40 mg/kg(含本底)为导致供试土壤-水稻-土壤微生物系统受到显著负效应的临界值，当供试土壤中S2-含量超出该浓度时，需采取合理的农艺措施控制其负效应。

硫离子；水稻生理指标；土壤微生物量；土壤微生物活性

1 材料与方法

1.1 土壤采集与水稻栽培

供试土壤为采自浙江大学紫金港试验场的水稻土。取表层0—20 cm土层、土样自然风干后过3.2 mm筛备用,供试土壤的基本理化性质见表1。分别称取4.0 kg相当于烘干土质量的风干土样置于系列80×20 cm3(底面积×高)塑料盆钵中，外源添加硫化钠。依据柴娟娟等调查发现我国华东地区冷浸田土壤S2-含量为296～1620 mg/kg[1]，设计外源S2-添加水平为0、10、50、100、300、600和1200 mg/kg(纯S2-计), 每个处理重复3次。同时拌入0.4 g/kg尿素(折合N 187 mg/kg)、0.4 g/kg磷酸氢二钾(P2O50.208 g/kg、K2O 0.139 g/kg)做基肥，混匀，淹水培养5 d后，移栽25日龄水稻秧苗，每盆定苗4株。试验过程中模拟冷浸田土壤低温浸水的还原态环境，在盆口覆保鲜膜以减少外界空气对内部土壤还原环境的氧化，盆底安装循环去热通水水槽以降低盆内土壤温度，整个生育期保证每天定时浇水补充盆内水分损失并始终保持2 cm水层以隔绝外部空气，常规管理。为避免自然水体中养分离子对后期试验的影响，本试验特选定符合GB17324-2003《瓶(桶)装饮用纯净水卫生标准》的纯净水为唯一供试用水，供试水稻品种为常规晚粳稻秀水134，试验在浙江大学紫金港校区网室进行。

1.2 样品采集

土壤样品于淹水预培养5 d后，在移栽水稻秧苗的15 d(苗期)、30 d(分蘖期)采集。用特制注射取样器(将医用50 ml注射器前端针孔与针管连接处平切成带活塞芯杆的圆柱管状采样器，利用芯杆拔出产生的气压采集土壤)，多点抽取0—10 cm表层土壤样品，样点(>3)均匀分布于离植株4～5 cm的圆周上。集中于封口袋中，用玻璃棒拌均，制成混合土样，测定新鲜土壤微生物数量、微生物量碳及S2-含量。

在水稻分蘖期阶段测定水稻株高及成活率，使用便携式叶绿素仪测定水稻倒三叶叶片SPAD值，采集水稻倒三叶放入垫有纱布的托盘中，冰浴冷冻处理，带回室内分析过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及脯氨酸含量。

1.3 测定方法

土样的基本理化性质采用常规分析方法；土壤S2-的测定方法为砷化器—亚甲蓝分光光度法[6-7]；土壤微生物量碳用氯仿熏蒸—0.5 mol/L K2SO4提取，T0C-500自动分析仪测定[8]；同类型的微生物数量采用稀释平板计数法测定[9]；叶绿素含量(SPAD值)—叶绿素仪非破坏性快速测定[10]；脯氨酸含量—磺基水杨酸提取，茚三酮比色法测定[11]；过氧化物酶(POD)活性—愈创木酚法测定[12]；超氧化物歧化酶(SOD)活性—采用南京建成生物公司SOD试盒进行，SOD抑制率达50%为一个亚硝酸盐单位，以Nu/g表示;过氧化氢酶(CAT)活性—氧电极法[13]土壤微生物活性和水稻生理指标皆用鲜样测定。

2 结果与讨论

2.1 不同水平外源S2-处理对分蘖期水稻生理指标的影响

2.1.1 外源S2-对水稻农艺性状的影响从表2可以看出，不同浓度外源S2-处理后，水稻的存活率和单株分蘖数都有一定的下降。其中，外源S2-10 mg/kg浓度处理以下无显著差异，长势良好；在10～50 mg/kg之间出现下降转折点，100 mg/kg处理以上存活率和单株分蘖数显著下降。在外源S2-10至100 mg/kg浓度水平，水稻的存活率分别约为空白处理的91%、64%和45%，1200 mg/kg时仅为空白处理的9%，差异显著(P<0.05)(表2)。外源S2-浓度大于50 mg/kg的土壤中生长的水稻叶片开始呈黄褐色，下部叶片逐渐枯死，分蘖期收获拔出水稻时发现秧苗根系发黑变臭，且随外源S2-浓度的增加，毒害症状越来越明显。土壤中S2-与二价铁、锰结合生成不溶性的黑色化合物，吸附在根系表面形成“黑根”，降低根系吸收养分的能力，进而显著抑制水稻的生长发育。

与植株存活率一样，植株株高、干物质积累量随外源S2-浓度的增加而显著降低，更为敏感的反映S2-的毒害胁迫。由表2分析可知，以水稻农艺性状抑制率(y)与土壤中理论总S2-含量(x)的曲线拟合相关方程式，y株高=-17.695+7.94lnx(r2=0.929)；y干物质=-32.098+14.821lnx(r2=0.960)分别求出株高抑制10%和20%的S2-临界浓度为33.30和115.29 mg/kg(土)；干物质积累减产10%和20%时的临界浓度分别为17.12 mg/kg和33.62 mg/kg，据此,以株高和干物质减产10%为依据，若加上供试土壤的本底S2-含量为12.17 mg/kg(土)，可初步推定供试水稻土S2-毒害的临界浓度约为30～40 mg/kg。

2.1.2 外源S2-对水稻抗氧化酶系统活性、叶绿素和脯氨酸含量的影响 H2S是动植物体内继NO和CO之后的新型气体信号分子[14]，能够参与并影响作物体内多种物质代谢活动。随着外源S2-浓度的增加，土壤逆境环境增强，导致叶片中H2S等有毒气体积累，引发多种自由基生成造成氧化胁迫。POD作为植物体内清除活性氧的主要酶类，在外源性S2-浓度低于10 mg/kg处理以下时显著增加，在10～50 mg/kg浓度范围内保持平稳，之后呈降低趋势(表3)。说明低浓度外源S2-能提高POD活性，高浓度S2-会破坏叶片抗氧化酶系统，使其活性降低。与POD的变化趋势一致，SOD活性在外源性S2-浓度低于50 mg/kg处理水平时表现出小幅波动，但无显著差异，之后下降并低于对照水平。CAT活性在外源S2-浓度为10 mg/kg时上升到达峰值，之后逐渐下降至对照水平以下。表明外源S2-浓度低于50 mg/kg是水稻的相对耐受区间，植物体内抗氧化酶系统能够有效抵御外界S2-胁迫的危害，但其保护作用有一定的限度，高浓度S2-诱导多种活性氧自由基积累并超过抗氧化酶系的保护作用，从而严重抑制三大保护酶系的活性。

注(Note): 同行数值后不同字母表示处理间差异达到5%显著水平 Values followed by different letters in a row are significantly different at the 5% level.

由表3可以看出，水稻叶片SPAD值呈现出先增加再缓慢降低的趋势，在外源性S2-为50 mg/kg时达到峰值，说明土壤中高浓度S2-会抑制叶片叶绿素的生成，这也是受毒害叶片呈黄褐色甚至枯死的原因。此外，叶片脯氨酸含量随S2-处理水平的增加而逐渐上升，研究结果与以往的报道相似[15]。与水稻叶片SPAD值相比，抗氧化酶系活性和脯氨酸含量是水稻抵御外源性S2-毒害更为敏感的生理指标。

注(Note): 同行数值后不同字母表示处理间差异达到5%显著水平 Values followed by different letters in a row are significantly different at the 5% level.

2.2 不同水平外源S2-处理对土壤生态系统的影响

2.2.1 不同生育期土壤S2-含量的变化由图1可知，土壤S2-含量在苗期和分蘖期与外源性S2-加入量成正相关关系，但由于土壤自身的缓冲作用和外界环境的氧化等影响，外源性S2-处理为50 mg/kg时的损失率分别为10.94%和27.27%，浓度为300 mg/kg时分别达18.48%和29.09%，损失程度随外源S2-处理水平和水稻的生长发育而加强。这主要是由于随着水稻的生长发育，外界环境温度升高，盆口覆膜等措施不足以消除外界环境对盆栽水稻内部土壤的氧化，S2-被氧化的程度随之加重，与土壤中二价铁锰等离子的结合也加强。因此，本试验选定水稻适应性生长的苗期和生命活动旺盛的分蘖期为研究重点，以期更准确的反映S2-处理对土壤-水稻-S2--微生物相互作用体系的影响。

[注(Note): 方柱上不同字母表示处理间在0.05水平有显著差异Different leffers above the bars inlicate significantly different among treatments at the 0.05 level.]

2.2.2 外源S2-对土壤微生物活性的影响

2.2.2.1 外源 S2-对土壤微生物量碳总量的影响土壤微生物量碳(SMB-C，简称生物量碳)表征土壤微生物的总量特征，是土壤有机碳中最为活跃的部分，参与土壤养分转化和能量循环过程，是土壤速效养分的活性库，与土壤肥力状况密切相关[16]。由图2可知，微生物量碳在不同水平外源S2-处理后呈较为显著的降低趋势: 在水稻苗期阶段，用10、50、100、300、600和1200 mg/kg 外源S2-处理后，土壤微生物量碳含量分别占空白处理的66.41%、54.38%、48.85 %、33.43%、25.12%和16.65%。水稻分蘖期阶段，分别为空白对照的133.57%、68.85%、72.75%、53.78%、65.38%和36.05%。其中，外源性S2-浓度为50mg/kg处理水平时，水稻两生育期土壤中微生物量碳含量平均分别为85.02和76.80 mg/kg，在我国冷浸田土壤中处于较低含量水平[9]。微生物量碳含量较低的土壤，其理化性质较差，供肥能力不足，无法满足作物的正常生长需要。

2.2.2.2 外源 S2-对土壤细菌、真菌、放线菌总量的影响研究表明，土壤中三大基础菌系包括细菌、真菌、放线菌三大类群微生物区系，在土壤有机质分解、转化过程中起到重要作用。在高浓度S2-的毒害下，基础菌系微生物数量大幅减少必然会导致有机质的循环矿化速度减缓、土壤有机质积累、养分供应失调，进而抑制水稻的生长发育。由图3可知，三大基础菌系微生物总量随外源S2-浓度的增加而显著减少: 水稻苗期阶段，在10～1200 mg/kg外源S2-处理下土壤基础菌系微生物总量分别为空白对照的59.26%、44.80%、20.82%、15.98%、15.00%和9.95%；分蘖期阶段分别为77.64%、50.55%、44.54 %、29.49%、29.40%和23.33%。此外，由于水稻分蘖期生命活动旺盛，土壤微生物反应强烈，基础菌系微生物总量总体高于水稻苗期生长发育阶段。基础菌系微生物总量在外源S2-浓度50 mg/kg水平以下随外源S2-增加而迅速减少，50 mg/kg水平以上平稳降低，可能是由于土壤部分基础菌系微生物对高浓度外源硫的胁迫适应性增强的缘故，其机理仍需进一步研究。

[注(Note): 方柱上不同字母表示处理间在0.05水平有显著差异Different leffers above the bars inlicate significantly different among treatments at the 0.05 level.]

2.2.2.3 外源S2-对土壤氨化细菌、固氮菌、纤维分解菌总量的影响土壤中三大功能菌系包括氨化细菌、固氮菌和纤维分解菌三类，是土壤中主要的降解性微生物，主要起到分解转化有机态氮素、固定大气中氮素和分解纤维素的作用，能够有效的促进土壤养分元素循环和污染物降解转化[17-18]。与上述基础菌系的变化趋势一致，随着外源性S2-浓度增加及其毒性的增强，土壤中三大功能菌系微生物活性受到显著抑制，导致其微生物总量先快速减少后保持平稳降低，并在外源性S2-浓度为50 mg/kg时发生下降转折点。由图4可知，外源性S2-浓度达50 mg/kg水平以上时，土壤中功能菌系微生物量在苗期和分蘖期平均分别仅占空白处理的23.84%和49.76%，不能够满足土壤中各元素循环的需要，容易造成土壤养分失调。

[注(Note): 方柱上不同字母表示处理间在0.05水平有显著差异Different leffers above the bars inlicate significantly different among treatments at the 0.05 level.]

2.2.2.4 外源S2-对土壤硫化细菌总量的影响硫在土壤中以多种形式存在，并在多种微生物的作用下发生相互转变以供给作物生长需要。其中，硫化细菌能将蛋白质分解时形成的H2S或硫氨基酸等转化成硫酸盐形式供植物吸收利用，进而减少土壤中H2S积累对植物造成的毒害作用[18]。由图5可知，不同浓度外源S2-处理后，水稻不同生育期土壤硫化细菌总量随外源S2-浓度的增加呈增加趋势。说明，随着外源S2-的浓度增加，土壤中硫化氢等还原性毒害物质逐渐增加，促使硫化细菌的活性增强以消减硫化氢胁迫。

[注(Note): 方柱上不同字母表示处理间在0.05水平有显著差异Different leffers above the bars inlicate significantly different among treatments at the 0.05 level.]

2.2.3 土壤微生物活性指标在水稻不同生育期的土壤S2-总量半效应浓度值由表4分析可知，水稻分蘖期阶段土壤-S2--微生物之间相互作用、相互影响的关系已趋于稳定，多数微生物活性指标土壤S2-总量的半效应浓度(EC50)[20-22]达40 mg/kg，且表现出显著相关性。意味着供试土壤S2-总量超出40 mg/kg后，土壤微生物生态系统将受到显著影响(表4)，微生物活性将显著降低，进而影响土壤的物质循环，包括土壤养分的矿化与供给等，这些影响最终导致水稻生长受到抑制，水稻多数生理指标和生长特征发生显著变化(表2，表3)。据此，上述结果进一步表明供试水稻土S2-毒害的临界浓度约为40 mg/kg(土)，超出此浓度需加强农艺技术措施以防止S2-毒害。

注(Note): BBA—基础菌总量Basic bacteria amount; FBA—功能菌总量Functional bacteria amount; BA—微生物总量Total bacteria amount; SMB-C—微生物量碳量Soil microbiomass carbon amount.

2.3 不同水平外源S2-处理后水稻生长与土壤微生物活性的相关性分析

表5表明，不同水平外源S2-处理后水稻农艺性状与其对应的水稻分蘖期土壤微生物活性指标存在显著正相关性，二者表征的供试土壤S2-毒害临界浓度范围吻合；相反，以过氧化物酶活性为代表的水稻抗氧化酶系统活性和水稻脯氨酸含量与供试土壤微生物活性指标负相关。上述结果说明，在本研究中，土壤-水稻-S2--微生物体系之间相互影响相互作用，相关影响是同步的，继而表现出各处理指标变化趋势存在显著相关性，外源S2-浓度超出一定浓度时，将严重破坏土壤-水稻-S2--微生物体系之间的协调关系，同步表现出抑制水稻生长、降低土壤微生物活性，因此当土壤中S2-浓度超出一定限制后，应加强农艺技术措施防止S2-毒害，保证土壤-水稻-S2--微生物体系的环境协调性，只有这样，才能保障水稻正常生长所需的环境，实现水稻的稳产与高产。

注(Note): BBA—基础菌总量Basic bacteria amount; FBA—功能菌总量Functional bacteria amount; BA—微生物总量Total bacteria amount; SMB-C—微生物量碳量Soil microbiomass carbon amount. *—P<0.05; **—P<0.01.

3 结论

1)过量S2-胁迫抑制了水稻地上部和根系的生长，在分蘖期，水稻生理指标如存活率、单株分蘖数及抗氧化酶系统活性也能较好地反映土壤S2-浓度对水稻生长的影响，多数指标的耐受性土壤外源性S2-浓度在50 mg/kg土以内，超出此浓度，上述水稻生理指标将受到到显著影响。同时，水稻植株株高和干物资积累量随外源S2-处理水平的增加而显著降低，通过拟合土壤S2-浓度与水稻生长抑制情况表明，供试土壤影响水稻生长的S2-胁迫临界浓度约为40 mg/kg。

2)在土壤—水稻生态系统中，土壤微生物量碳、微生物总量、基础菌(细菌、真菌、放线菌)总量和功能菌(氨化细菌、固氮菌、纤维分解菌)总量都随外源S2-处理水平的增大而降低，多数微生物活性指标(微生物基础菌系总量、功能菌系总量、微生物总量)的土壤S2-总量EC50为40 mg/kg，与水稻农艺性状表征的临界浓度吻合，从土壤微生物毒理学角度分析，进一步表明40 mg/kg是供试土壤S2-毒害的临界浓度。

3)在土壤-水稻-S2--微生物相互作用的体系中，不同水平外源S2-处理后水稻生长与土壤微生物活性存在显著相关性，表明S2-对土壤-水稻-微生物体系的相关影响是同步的，因此在实际农业生产中应注意土壤S2-的积累对土壤-水稻-微生物生态系统的影响，S2-含量达到产生负效应浓度时，应加强农艺技术措施以防止S2-毒害。

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EC50of soil S2-inhibiting rice growth and soil microbial activities

XIE Xiao-mei1,2， LIAO Min1,2*, ZHANG Nan1,2, XU Pei-zhi3, XU Chang-xu4, LIU Guang-rong4

(1CollegeofEnvironmentalandResourceSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058; 2ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofSubtropicalSoilandPlantNutrition,Hangzhou310058; 3InstituteofSoil&Fertilizer,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,Guangzhou510640; 4InstituteofSoil&FertilizerandResource&Environment,JiangxiAcademyofAgriculturalSciences,Nanchang330200)

【Objectives】S2-is one of the important limiting factors for rice growth in cold waterlogged paddy fields which are typical low yield paddy fields. Characteristics of ecological toxicity of S2-to system of soil-rice under S2-stress were investigated in order to provide a theoretical basis for future research to reveal the dose critical value of S2-toxicity and its toxic mechanism in cold waterlogged paddy soil. 【Methods】 Effect of exogenous S2-treatment on rice physiological indices(rice physiological growth, chlorophyll, proline and the activities of the antioxidant enzyme system in the rice leaves), soil microbial activities and their bioecological characters at the seedling and tillering stages in the interactive system of soil-rice-S2-and microbe were studied by a greenhouse pot experiment which is set to simulate S2-toxicity in waterlogged paddy soil. A single season conventional late japonica rice Xiushui 134 was selected as crop material, and S2-was applied at seven different levels in one paddy soil, namely 0, 10, 50, 100,300, 600 and 1200 mg/kg. 【Results】 The addition of exogenous S2-gradually inhibits the growth of rice and decreases soil microbial activities in the normal tested paddy soil in which the background S2-concentration is 12.08 mg/kg. The plant height and dry matter accumulation of rice decrease sharply when the exogenous S2-concentration exceeds 50 mg/kg. However, SPAD value of chlorophyll content in rice leaves, proline accumulation and activities of antioxidant enzyme systems are increased significantly. These results suggest that exogenous S2-of 50 mg/kg is the critical concentration under the tested condition to poison rice growth. Meanwhile, soil microbial activities are declined rapidly with the increase of the concentration of exogenous S2-. The turning point of decreasing soil microbial activities can be presumed as 40 mg/kg of soil S2-concentration by analyzing its toxicant concentration that inhibits a microbe-mediated ecological process by 50%(EC50). Soil microbial activities and rice growth in the system of soil-rice-S2-and microbe are significantly associated and synchronously affected by S2-in the tested soil. Overall, soil S2-of 40 mg/kg is the critical concentration to inhibit the system of soil-rice-soil microbe in the tested soil. 【Conclusion】 When the concentration of S2-in soil exceeds a certain concentration, S2-would lead to significantly negative effects on the system of soil-rice-soil microbe. Soil S2-of 40 mg/kg is the critical concentration to inhibit the system of soil-rice-soil microbe in the tested soil. Therefore, some reasonable agronomic measures should be taken to control the negative effects once the concentration of S2-is over 40 mg/kg in the test paddy soil.

sulfur ion; rice physiological indices; soil microbial biomass; soil microbial activities

2014-08-18 接受日期: 2014-12-01 网络出版日期: 2014-04-20

国家公益性行业(农业)专项(201003059)资助。

谢晓梅(1970—)，女，博士，高级工程师，从事环境科学与环境生态方面的研究。 E-mail: xiexiaomei@zju.edu.cn， Tel: 0571-88982719。 *通信作者E-mail: liaomin@zju.edu.cn, Tel: 0571-88982063

S154.34;S511.2

1008-505X(2015)05-1286-08